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α CaMKⅡ在小鼠杏仁核突触可塑性及灵活性学习中的作用

作　者: 安述明
导　师: 曹晓华
学　校: 华东师范大学
专　业: 生理学
关键词: CaMKII 突触可塑性杏仁核灵活性学习条件恐惧记忆的消退厌恶性记忆
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

大量的研究证明,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在学习与记忆和突触可塑性中发挥着重要的作用。2003年Tsien带领的科研小组成功创建出蛋白修饰的αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠。该转基因模式小鼠有许多优点:1)区域特异性,使用αCaMKⅡ启动子,实现了αCaMKⅡ在前脑皮层、海马和杏仁核等区域特异性过量表达。2)分子特异性,根据蛋白工程原理设计筛选出与过量表达的αCaMKⅡ-F89G是“锁和钥匙”关系的特异性抑制物(NM-PP1),NM-PP1能够特异性地与外源αCaMKⅡ-F89G结合并抑制该酶的活性。3)激酶活性的实时可控性,利用腹腔注射小分子抑制物的方法(NM-PP1,16.6ng/g,小鼠体重),可在几分钟内抑制外源αCaMKⅡ-F89G的活性。而小鼠长期口服小分子抑制物(5μM,饮用水)无明显副作用,效果显著,抑制物去除后,蛋白激酶可恢复活性。实现了在整体动物上,对αCaMKⅡ激酶进行可逆性(reversible)和诱导性(induceble)的实时调控(分钟级)。以往的研究多集中于αCaMKⅡ在一种固定规则学习任务中的作用,但是αCaMKⅡ在非固定规则学习任务即灵活性学习中的作用却少有研究。灵活性学习在动物适应多变的环境从而得以生存方面起着重要的作用。已有研究表明灵活性学习主要和LTD有关。另有研究证实LTD的诱导和αCaMKⅡ密切相关。前脑过量表达αCaMKⅡ对于杏仁核突触可塑性及杏仁核相关的灵活性学习是否产生影响?与其相关的分子与细胞机制是什么?为了解答这些问题,本研究利用蛋白修饰αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠,将离体脑片电生理技术、整体行为学和形态学方法相结合。重点研究了前脑过量表达的αCaMKⅡ对丘脑——杏仁核LA区(T-LA)通路的NMDA受体依赖性的长时程减弱(Long-term Depression,LTD)、长时程增强(Long-term Potentiation,LTP)、杏仁核和海马相关的再学习及情绪行为的影响。本课题研究主要包括以下五个部分:1αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠杏仁核脑区突触可塑性的研究1.1基本突触传递分析采用离体脑片场电位记录技术,考察了前脑特异性过量表达αCaMKⅡ对转基因模式小鼠丘脑传入纤维投射到杏仁核(T-LA)通路的基本突触传递功能影响。分析比较了αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠与同窝对照小鼠的兴奋性突触后电位的刺激强度-反应关系(Input-Output curve)和双脉冲抑制反应(Paired pulsedepression,PPD)。结果显示αCaMKⅡ转基因小鼠杏仁核Input-Output和PPD曲线与同窝对照组相比无显著性差异。提示了αCaMKⅡ在前脑的过量表达不改变转基因模式小鼠突触后AMPA受体的功能和突触前神经递质释放的功能。1.2不同频率的刺激对杏仁核突触可塑性分析采用离体脑片场电位记录技术,研究了αCaMKⅡ在前脑特异性过量表达对小鼠丘脑传入纤维投射到杏仁核LA区(T-LA)通路的突触可塑性的影响。结果显示,与同窝对照小鼠相比,低频刺激(1Hz,15min和3Hz,5min)在αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠上都不能诱导出显著的LTD现象。而在相同的刺激条件下,在人工脑脊液中加入αCaMKⅡ-F89G特异性拮抗剂NM-PP1(0.5μM)能补偿αCaMKⅡ-F89G转基因鼠杏仁核LTD缺陷。当NM-PP1和NMDA受体拮抗剂APV(50μM)同时加入时,也能够抑制αCaMKⅡ-F89G转基因鼠和同窝对照鼠杏仁核LTD。使用中频刺激(10Hz,1.5min)后,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠杏仁核的突触反应无显著的变化。最后分别采用Theta burst刺激和高频强直刺激方法,在两组脑片上都能够诱导出稳定的LTP,两组之间无显著性差异。由此认为,αCaMKⅡ参与了杏仁核脑区NMDAR依赖性的LTD的形成,αCaMKⅡ前脑的过量表达可以引起NMDAR依赖的LTD的缺陷。但前脑过量表达αCaMKⅡ对转基因组杏仁核LTP现象无显著影响。总之,αCaMKⅡ在前脑特异性过量表达对小鼠T-LA通路的突触可塑性频率反应曲线产生显著性影响。结果表明,前脑特异性过量表达αCaMKⅡ抑制T-LA突触的NMDA受体依赖性的LTD,而不影响LTP的诱导。2αCaMKⅡ-F89G转基因模式小鼠灵活性学习能力研究尽管CaMKⅡ在学习与记忆中的作用已经有不少的研究报道,但CaMKⅡ在灵活性学习中的作用却少有研究。为了研究αCaMKⅡ在前脑过量表达对小鼠的灵活性学习能力的影响,选用3月龄αCaMKⅡ-F89G转基因鼠和同窝对照野生型鼠进行Morris水迷宫实验、条件恐惧记忆消退实验(Fear extinction)和条件味觉厌恶记忆消退实验(Extinction of conditioned taste aversion)。结果显示,(1)在Morris水迷宫实验的可视平台测试中,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠的视觉和求生的动机表现正常;在定位航行训练和第一次空间探索测试中,两组鼠在逃避潜伏期及目标象限探索时间无统计学差异;但是在反向定位空间学习阶段,转基因组在第二、三天逃避潜伏期和游泳距离明显长于同窝对照组。(2)条件恐惧记忆消退实验中,在测试阶段第三、四、五天,转基因组对条件刺激(声音和场景)产生惊吓反应程度显著高于同窝组照组;当αCaMKⅡ-F89G转基因鼠在整个消退测试阶段接受特异性拮抗剂NM-PP1时,其惊吓反应程度对照组相比无显著性差异。(3)条件味觉厌恶记忆消退实验中,在测试阶段的第二、三天,转基因组对糖精钠溶液的厌恶指数显著高于对照组;而在消退测试阶段中,当αCaMKⅡ-F89G转基因鼠饮用含有NM-PP1的水和糖精钠溶液时,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠对糖精钠溶液厌恶程度与对照组相当。在自然状态下,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠和同窝对照鼠对糖精钠溶液的偏好程度和对奎宁溶液的厌恶程度无统计学差异。结果表明,前脑特异性过量表达αCaMKⅡ降低αCaMKⅡ-F89G转基因鼠灵活性学习能力。3αCaMKⅡ-F89G转基因模式小鼠厌恶性动机学习能力研究已有研究证明前脑特异性过量表达αCaMKⅡ损伤αCaMKⅡ-F89G转基因鼠条件恐惧记忆(Fear conditioning memory)和新异物体识别记忆(Novel objectrecognition memory)。但前脑过量表达αCaMKⅡ对于其它类型厌恶性动机学习与记忆影响未有报道,我们利用跳台实验、被动回避实验和条件味觉厌恶实验检测不同感觉为基础的厌恶性记忆。结果显示,在跳台和被动回避实验测试中,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠潜伏期显著短于同窝对照组;在条件味觉厌恶实验测试中,该转基因小鼠对糖精钠溶液厌恶程度显著低于同窝对照组。但在厌恶性记忆检测前15min腹腔注射NM-PP1后,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠表现正常。实验表明前脑过量表达αCaMKⅡ将损伤αCaMKⅡ-F89G转基因鼠的厌恶性动机记忆。提示前脑αCaMKⅡ在厌恶性动机记忆提取阶段发挥着重要的作用。4αCaMKⅡ-F89G转基因模式小鼠基本运动能力及情绪行为的研究为了进一步验证αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠的灵活性学习及厌恶性学习能力降低是否由于αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠的基本活动量和情绪行为异常造成的。我们选用开场、转棒实验、高架十字迷宫、强迫游泳和悬尾实验进行测试。结果显示,在开场和转棒实验测试中,αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠的基本活动量、探究行为、体力和运动协调能力与同窝对照组相比无显著性差异。高架十字迷宫、强迫游泳和悬尾实验中,αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠在焦虑及抑郁等情绪方面表现正常。由此认为,αCaMKⅡ在前脑过量表达不影响转基因小鼠的基本活动量及情绪行为。证实了αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠在灵活性学习和厌恶性学习任务中的行为缺陷是由其学习记忆能力下降导致的。5αCaMKⅡ-F89G转基因模式小鼠前脑形态学研究用尼氏染色技术显示3-4月龄αCaMKⅡ-F89G转基因鼠和野生对照鼠前脑海马、杏仁核和岛叶的形态,并进行了比较。结果显示,与对照鼠相比,αCaMKⅡ-F89G转基因鼠海马、岛叶及杏仁核等形态结构显示正常。提示前脑特异性过量表达αCaMKⅡ不改变αCaMKⅡ-F89G转基因鼠前脑海马、杏仁核和岛叶皮层的形态结构。本研究结果提示,αCaMKⅡ在前脑过量表达对αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠的灵活性学习有损伤作用,推测这种损伤有可能由前脑LTD的缺陷造成的。而αCaMKⅡ在前脑过量表达对αCaMKⅡ-F89G转基因小鼠的情绪行为影响不大。本文为阐明灵活性学习的分子机制提供了实验数据。

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论文摘要  6-10
ABSTRACT  10-15
第一章:αCaMKII-F89G转基因小鼠杏仁核脑区突触可塑性研究  15-36
  摘要  15-16
  1 材料和方法  16-19
  2 实验结果  19-31
  3 讨论  31-36
第二章:αCaMKII-F89G转基因小鼠灵活性学习能力研究  36-59
  摘要  36
  1 材料和方法  36-43
  2 结果  43-54
  3 讨论  54-59
第三章:αCaMKII-F89G转基因小鼠厌恶性动机学习研究  59-67
  摘要  59
  1 材料和方法  59-62
  2 结果  62-65
  3 讨论  65-67
第四章:αCaMKII-F89G转基因小鼠基本行为及情绪的研究  67-75
  摘要  67
  1 材料和设备  67-68
  2 实验方法  68-69
  3 实验结果  69-73
  4 讨论  73-75
第五章:αCaMKII-F89G转基因小鼠前脑形态学研究  75-78
  摘要  75
  1 材料和方法  75-76
  2 结果  76
  3 讨论  76-78
文献综述  78-83
缩略语及符号  83-84
研究论文及会议摘要  84-85
参考文献  85-93
致谢  93

α CaMKⅡ在小鼠杏仁核突触可塑性及灵活性学习中的作用

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