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肝细胞生长因子对高糖诱导的腹膜纤维化的影响

作　者: 修亦斌
导　师: 郭汉城
学　校: 福建医科大学
专　业: 内科学
关键词: 肝细胞生长因子 人腹膜间皮细胞 腹膜纤维化 高糖
分类号: R572
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


研究背景和目的:PD是ESRD患者的主要肾替代治疗方法之一。但是长期暴露于生物不相容性的PDF中的腹膜易损伤,逐渐进展为腹膜纤维化,导致超滤失败,溶质清除障碍,影响PD疗效。高糖环境上调TGF-β1的表达并诱导HPMCs发生EMT是腹膜纤维化启动和维持的关键过程。而目前认为HGF和TGF-β1之间的平衡在决定损伤组织是痊愈还是纤维化起着关健的作用。众多研究表明,HGF是内在的抗纤维化因子。本研究主要探讨外源性HGF能否影响高糖环境培养下的HPMCs的TGF-β1表达,并阻止HPMCs发生EMT,减少ECM的合成。探讨HGF对腹膜纤维化的防治作用,为保护长期PD患者的腹膜功能提供新的治疗策略。方法:通过胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离出HPMCs并进行原代培养,通过形态学和免疫组化进行腹膜间皮细胞鉴定,取第三代细胞用于实验。细胞亚融合后在无血清培养基中同步化24小时,然后在不同葡萄糖浓度环境（5.5,30,60mmol/LD-葡萄糖,54.5mmol/L甘露醇）及高糖环境中（60mmol/L D-葡萄糖）加入不同浓度的rhHGF（25,50,100ng/ml）培养48小时。ELISA方法检测细胞培养上清液TGF-β1、FN蛋白水平,免疫组化方法检测HPMCs之α-SMA的蛋白表达,并通过IOD测定进行半定量分析。通过荧光定量PCR检测HPMCs之TGF-β1,FN,α-SMA mRNA的表达。结果:1、原代培养的HPMCs开始以梭形的成纤维细胞样生长,约一周后融合并表现为“铺路石”状,免疫组化显示角蛋白和波形蛋白表达阳性。2、在高糖环境培养下的HPMCs之α-SMA、TGF-β1、FN蛋白和基因表达水平与对照组比较都明显增加（P＜0.05）,并呈剂量依赖关系（P＜0.01）。甘露醇组与对照组比较无明显增加。3、HGF在蛋白和基因水平可抑制高糖诱导的HPMCs之α-SMA、TGF-β1、FN表达（P＜0.05）,并呈剂量依赖关系（P＜0.01）。结论:1、HPMCs在高糖环境培养下,TGF-β1的表达上调,并诱导了HPMCs的EMT,促进HPMCs合成ECM。2、外源性的HGF可抑制高糖诱导的HPMCs TGF-β1的表达,并阻止HPMCs的EMT和减少ECM的分泌,提示HGF具有抑制腹膜纤维化的生物学功能,为临床防治PD相关的腹膜纤维化提供理论依据和新的治疗思路。

全文目录


中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
缩略词表  8-10
前言  10-11
材料与方法  11-23
  一、 材料  11-13
    (一) 主要的试剂  11-12
    (二) 主要的仪器  12-13
  二、 方法  13-23
    (一) 人腹膜间皮细胞原代培养  13
    (二) 人腹膜间皮细胞传代培养  13-14
    (三) 人腹膜间皮细胞免疫组织化学染色鉴定  14-15
    (四) 实验细胞分组  15-16
    (五) 免疫组织化学技术测定细胞 α-SMA 的表达  16-17
    (六) 相对定量实时荧光 PCR 测定 α-SMA、TGF-β_1、FN mRNA 基因表达  17-20
      1.细胞总 RNA 的提取  17
      2.cDNA 的合成  17-18
      3.PCR 引物设计及合成  18
      4.相对定量实时荧光 PCR(荧光染料法)  18-20
    (七) FN 蛋白的检测  20-21
    (八) TGF-β_1 蛋白的检测  21
    (九) 统计学方法  21-23
结果  23-35
  一、 细胞培养及鉴定  23-26
    1.细胞生长情况  23
    2.免疫组织化学染色鉴定  23-26
  二、 免疫组织化学检测细胞表型转化标志物 α-SMA 的表达  26-30
    1.高糖环境对 HPMCs 表达 α-SMA 的影响  26
    2.HGF 对高糖环境培养下的 HPMCs 表达 α-SMA 的影响  26-30
  三、 ELISA 法检测上清液中 FN、TGF-β_1 的含量  30-33
    1.高糖对人腹膜间皮细胞分泌 FN 的影响  31
    2.HGF 对高糖环境下人腹膜间皮细胞分泌 FN 的影响  31
    3.高糖对人腹膜间皮细胞分泌 TGF-β_1 的影响  31
    4.HGF 对高糖环境下人腹膜间皮细胞分泌 TGF-β_1 的影响  31-33
  四、 相对定量实时荧光 PCR 检测 α-SMA、TGF-β_1、FN 基因表达  33-35
    1.总 RNA 的纯度和完整性分析  33
    2.熔解曲线、扩增线性与效率  33
    3.高糖对 HPMCs 表达 α-SMA、TGF-β_1、FN mRNA 的影响  33-34
    4.HGF 对高糖环境下 HPMCs 表达 α-SMA、TGF-β_1、FN mRNA 的影响  34-35
讨论  35-40
结论  40-41
参考文献  41-45
致谢  45-46
综述  46-54
  参考文献  52-54

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 消化系及腹部疾病 > 腹部疾病
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