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应用重组人类眼角膜细胞模型评估眼暴露刺激与炎症反应

作　者: 曹毅
导　师: 杨旭；S(?)ren K Kj(?)rgaard
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人类眼角膜上皮细胞眼暴露刺激炎症
分类号: R77
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

在办公室与其它类似工作环境中,眼暴露刺激是一种常见的健康症状。对眼暴露刺激的原因及其机制的深入了解有助于提高工作环境质量。同时,当今社会人们与各种可能含有刺激性化学试剂的产品例如化妆品,药剂,工业药品接触越来越频繁,在保证人类能安全地与这些化学试剂接触前,很有必要研究这些化合物的眼暴露刺激性。目前,关于人类眼暴露刺激性的实验室研究主要基于Draize兔子眼刺激性试验,但该方法目前已经受到诸多质疑,尤其是这种方法太残忍。同时,这种方法无法评估人眼的炎症过程,而且由兔子眼睛外推到人眼睛可能是一种比较困难的过程。在本试验中,使用人类眼角膜细胞模型作为体外模型,研究模式化合物脂多糖以及典型环境污染物灰尘暴露对人类眼暴露刺激和炎症反应的影响,主要试验过程与结果如下:Ⅰ.使用不同浓度脂多糖6h暴露人类眼角膜细胞,用MTT方法研究细胞活力变化以反映眼暴露刺激性,用ELISA方法研究培养基中IL-1β,IL-8和TNFα浓度变化以反应眼角膜炎症反应过程,结果发现,脂多糖暴露对细胞百分比活力有一定影响,但这种影响没有明显的剂量.效应关系,而且细胞百分比活力下降并不显著,提示脂多糖对人类眼暴露刺激的影响有限。使用这种脂多糖6h暴露原代培养人类口腔上皮细胞发现,脂多糖仅导致细胞活力不显著下降,进一步提示脂多糖对人类上皮细胞活力影响有限。ELISA研究发现,IL-1β能在各实验组中检测到,但浓度都很低,且无差异显著性,TNFα在培养基中几乎不被检出,而IL-8则极显著性上升(p＜0.01,与对照组比较),结果提示,在脂多糖暴露了下,IL-1β与TNFα并不被激活,而IL-8炎症反应被激活,脂多糖能引起人类眼角膜细胞炎症反应。Ⅱ.使用不同浓度的灰尘溶液24h暴露人类眼角膜细胞,用MTT方法研究细胞活力变化以反映眼暴露刺激性,用ELISA方法研究培养基中IL-1β,IL-8和TNFα浓度变化以反应眼角膜炎症反应过程,结果发现,低浓度灰尘溶液(0.05mg/ml和0.5mg/ml)暴露对细胞活力与IL-1β,IL-8和TNFα浓度无明显影响,提示低浓度灰尘溶液并不导致人眼暴露刺激和炎症反应的发生。高浓度灰尘溶液(15mg/ml和30mg/ml)24h暴露导致细胞活力显著性下降,并导致IL-1β浓度显著性上升,以及IL-8浓度依剂量-效应关系上升,但TNFα浓度无明显变化,提示高浓度灰尘能导致人类眼暴露刺激效应,以及IL-1β与IL-8炎症因子反应,但1NFα并不参与这一炎症反应过程。Ⅲ.以不同湿度条件,不同沉降条件与不同总量灰尘溶液暴露人类眼角膜细胞,研究不同环境因素与灰尘条件对人类眼角膜细胞活力与炎症因子的影响,结果发现,饱和湿度条件下,灰尘溶液引起细胞活力与IL-1β和IL-8炎症因子显著性变化的起始浓度明显升高;同时,同样浓度的灰尘溶液经过15min放置以后,引起的人类眼角膜细胞活力下降较不经过放置的新鲜灰尘溶液显著性上升(p＜0.05)。这些结果提示湿度条件与灰尘沉降对试验结果有较大影响,控制湿度条件和使用新鲜灰尘溶液对得到可靠的试验结果很重要。同时,0.2ml 15mg/ml灰尘溶液暴露与0.1ml15mg/ml灰尘溶液暴露引起的细胞活力变化与细胞因子变化比较一致,而与0.1ml30mg/ml灰尘溶液暴露引起的细胞活力变化与细胞因子变化有比较明显的区别,提示在这种眼角膜细胞模型中,对试验结果影响更大的是所暴露的灰尘溶液浓度,而非灰尘溶液的总量;Ⅳ.以组织学方法观察人类眼角膜细胞形态变化发现,PBS组人类眼角膜细胞无形态学变化,细胞厚度较大;SDS阳性对照组细胞发生多种形态变化,如细胞死亡,脱落,出现大量空泡等;500μg/ml灰尘溶液暴露组,细胞厚度变小,但细胞结构保持完好,无明显空泡:5mg/ml灰尘溶液暴露组细胞厚度进一步减小,开始出现空泡,但细胞3D结构保持完好。组织学检测的结果与MTT试验结果较一致;Ⅴ.以扫描电镜观察灰尘表面,可观察到灰尘是有多种成份组成,包括非有生命成分与有生命的细菌,真菌等成分,因此灰尘溶液导致人眼暴露刺激与炎症反应是其多种组分共同作用的结果。以上结果表明,人类眼角膜细胞能用于眼暴露刺激与炎症反应的体外毒理学研究,高浓度灰尘能导致人类眼暴露刺激,细胞因子IL-1β和IL-8参与其中的炎症反应过程,可作为生物标志物;脂多糖具有一定的眼暴露刺激性,细胞因子IL-8参与其中的炎症反应过程,而无IL-1β反应。TNFα在以上两种炎症反应过程中都不参与。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
一、文献综述  10-17
  1 眼暴露刺激问题概述  10-11
    1.1 环境中的眼暴露刺激问题  10-11
    1.2 化学药品使用前的眼暴露刺激潜在危险测试  11
  2 灰尘的刺激作用与致炎症反应作用  11-12
    2.1 灰尘刺激作用的流行病学调查与控制暴露试验  11
    2.2 灰尘致炎症作用  11-12
  3 眼暴露刺激研究方法  12-15
    3.1 流行病学调查与控制暴露人体试验  12-13
    3.2 Draize兔子眼睛刺激性试验及其体外替代试验  13-14
    3.3 人类眼角膜细胞模型  14-15
  4 试验目的、整体设计及意义  15-16
    4.1 试验目的  15
    4.2 整体设计  15-16
    4.3 试验意义  16
  5 论文特点及创新  16-17
二、材料与方法  17-22
  1.实验材料  17
    1.1 重组人类眼角膜模型与质量控制  17
    1.2 原代培养人类口腔上皮细胞  17
    1.3 主要试剂  17
    1.4 主要实验仪器  17
  2.实验方法  17-22
    2.1 细胞的准备  17-19
    2.2 眼暴露刺激物的准备与细胞暴露  19-20
    2.3 细胞活力检测试验(MTT试验)  20
    2.4 ELISA试验检测细胞因子  20-21
    2.5 扫描电镜试验  21
    2.6 组织学检测  21
    2.7 数学统计  21-22
三、实验结果  22-37
  1 LPS的刺激效应和炎症效应  22-24
  2.灰尘溶液的刺激效应和炎症效应  24-34
    2.1 低浓度灰尘溶液的刺激效应和炎症效应  24-26
    2.2 培养箱湿度条件和灰尘沉降对MTT和ELISA试验结果的影响  26-29
    2.3 高浓度灰尘溶液的刺激效应与炎症效应  29-31
    2.4 不同总量的灰尘溶液对MTT和ELISA试验结果的影响  31-34
  3.组织学检测试验结果  34
  4.扫描电镜试验结果  34-37
四、讨论、结论与展望  37-43
  1.讨论  37-41
    1.1 LPS对人类眼角膜细胞刺激性与致炎症效应探讨  37
    1.2 灰尘致人类眼角膜细胞刺激性与致炎症效应探讨  37-38
    1.3 灰尘溶液处理与环境因素对灰尘作用的影响  38
    1.4 IL-1β,IL-8与TNFα在眼暴露刺激中的参与作用  38-40
    1.5 本试验模型的不足  40-41
  2.结论  41
  3.展望  41-43
参考文献  43-46
附录一  46-47
附录二  47-48
致谢  48-49

应用重组人类眼角膜细胞模型评估眼暴露刺激与炎症反应

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