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禽流感病毒NA1和NA2基因重组杆状病毒的表达及N1和N2抗体ELISA检测方法的建立

作　者: 李庆妮
导　师: 李慧姣；蒋桃珍
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒 NA1和NA2基因 杆状病毒表达系统 ELISA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


为获得利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内表达禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶N1和N2蛋白,本研究利用RT-PCR方法得到H5N1和H9N2亚型AIV的NA1和NA2基因,将目的基因分别克隆到杆状病毒转移载体pFastBactHTA上,获得重组转移载体pFastBacHTA-NA1和pFastBacHTA-NA2,再将其转化到DH10Bac细胞中得到重组穿梭载体Bacmid-NA1和Bacmid-NA2,转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒vBac-NA1和vBac-NA2。将重组杆状病毒的表达产物经Western-blot分析后可见大小分别约为55KD和53KD的特异性条带,神经氨酸酶活性试验结果呈粉红色。随后,对目的蛋白的表达条件进行了探索性优化,确定了重组病毒感染后120h是细胞最适收获时间,此时N1和N2蛋白的表达量分别占细胞总蛋白的2.1%和1.7%。试验表明vBac-NA1和vBac-NA2在昆虫细胞sf9中成功表达了AIV的N1和N2蛋白,并且表达的N1和N2蛋白具有神经氨酸酶活性,能够和相应的多克隆血清发生特异性反应,相互之间无交叉反应。为建立间接ELISA方法以鉴别鸡血清中AIV神经氨酸酶的N1和N2抗体,本研究将重组杆状病毒表达的N1和N2蛋白作为包被抗原,确定了酶标二抗最适稀释度、抗原包被最适稀释度、血清最适稀释度、最适封闭液、血清最适作用时间、酶标二抗最适作用时间、最适显色时间和结果判定标准。对建立的间接ELISA方法进行特异性、敏感性试验和重复性试验。利用该方法检测64份禽流感H5N1和H9N2亚型抗体阳性的鸡血清,与NIT相比,对N1抗体检测的符合率为95.3%,对N2抗体检测的符合率为96.8%。该方法可鉴别出目前使用的7种禽流感疫苗免疫后血清中AIV神经氨酸酶N1和N2抗体。结果表明建立的间接ELISA方法有较高的特异性和敏感性,可以用于鉴别鸡血清中AIV神经氨酸酶的N1和N2抗体。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
缩略词表  5-8
第一章 引言  8-15
  1.1 禽流感病毒神经氨酸酶的结构与功能  8-10
  1.2 禽流感检测方法研究进展  10-12
  1.3 杆状病毒表达系统  12-14
  1.4 本研究的目的和意义  14-15
第二章 禽流感病毒NA1和NA2基因重组杆状病毒的表达  15-38
  2.1 材料  15-17
    2.1.1 禽流感病毒毒株  15
    2.1.2 载体,菌株和细胞  15
    2.1.3 主要鸡血清  15
    2.1.4 主要试剂  15-16
    2.1.5 所用溶液及其配制  16
    2.1.6 主要仪器设备  16-17
  2.2 方法  17-27
    2.2.1 RT-PCR扩增目的基因NA1和NA2  17-19
    2.2.2 重组转移载体pFastBacHTA-NA1和pFastBacHTA-NA2的构建  19-21
    2.2.3 重组穿梭载体Bacmid的构建  21-22
    2.2.4 重组杆状病毒的获得和鉴定  22-24
    2.2.5 表达产物的检测与鉴定  24-26
    2.2.6 表达条件的优化  26
    2.2.7 目的蛋白的纯化  26-27
  2.3 结果  27-35
    2.3.1 RT-PCR扩增目的基因NA1和NA2  27
    2.3.2 重组转移载体pFastBacHTA-NA1和pFastBacHTA-NA2的构建  27-28
    2.3.3 重组穿梭载体Bacmid的构建  28-29
    2.3.4 重组杆状病毒的鉴定  29-30
    2.3.5 表达产物的检测与鉴定  30-33
    2.3.6 表达条件的优化  33-34
    2.3.7 目的蛋白的纯化  34-35
  2.4 讨论与小结  35-38
    2.4.1 关于表达系统的选择  35
    2.4.2 关于重组穿梭载体Bacmid的构建  35-36
    2.4.3 关于转染  36
    2.4.4 关于目的蛋白的表达  36-37
    2.4.5 关于目的蛋白的检测方法  37
    2.4.6 小结  37-38
第三章 检测禽流感病毒N1和N2抗体间接ELISA方法的建立  38-54
  3.1 材料  38-39
    3.1.1 主要试剂和材料  38
    3.1.2 主要器材和设备  38
    3.1.3 实验动物  38-39
    3.1.4 疫苗  39
    3.1.5 所用溶液及配制  39
  3.2 方法  39-42
    3.2.1 间接ELISA的操作步骤  39
    3.2.2 间接ELISA相关试验条件的确定试验  39-41
    3.2.3 间接ELISA判定标准的确定  41
    3.2.4 间接ELISA的特异性、敏感性和重复性试验  41-42
    3.2.5 间接ELISA的初步应用  42
  3.3 结果  42-51
    3.3.1 间接ELISA相关试验条件的确定试验  42-47
    3.3.2 试验结果的判定  47
    3.3.3 间接ELISA特异性、敏感性和重复性试验  47-50
    3.3.4 间接ELISA的初步应用  50-51
  3.4 讨论与小结  51-54
    3.4.1 关于AIV神经氨酸酶N1和N2亚型的鉴别  51
    3.4.2 关于间接ELISA方法的建立  51-52
    3.4.3 关于ELISA方法与NIT方法的比较  52
    3.4.4 关于间接ELISA的初步应用  52
    3.4.5 小结  52-54
第四章 结论  54-55
第五章 对下一步研究的设想  55-56
参考文献  56-61
致谢  61-62
附录  62-74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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