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猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株和变异毒株NASBA-ELISA鉴别诊断方法的建立及应用

作　者: 梁海霞
导　师: 夏业才；郎洪武
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典毒株和变异毒株酸序列依赖性扩增 ELISA 鉴别诊断
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸练合征病毒(PRRSV)的基因序列,建立了3种核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,NASBA)-ELISA:NASBA-ELISA(A)、NASBA-ELISA(C)和NASBA-ELISA(V)方法,分别用于检测美洲型PRRSV,并鉴别PRRSV经典毒株和变异毒株。用建立的NABSA-ELISA方法和商品化RT-PCR试剂盒,同时检测人工感染PRRSV不同毒株的猪,以比较NASBA-ELISA和RT-PCR方法检测PRRSV的敏感性。针对PRRSVORF7基因和ORF1a中Nsp2基因的保守序列以及Nsp2基因缺失信息,设计并合成3组引物和探针。通过优化反应条件,建立了扩增美洲型PRRSV,PRRSV经典毒株和PRRSV变异毒株RNA的NASBA方法:NASBA-A,NASBA-C和NASBA-V。NASBA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见有预期大小的目的条带。NASBA扩增产物经northern印迹进一步验证了NASBA扩增的特异性,同时也表明检测探针具有特异性。然后通过优化ELISA反应条件,建立了检测NASBA扩增产物的ELISA方法。对建立的NASBA-ELISA(A)、NASBA-ELISA(C)和NASBA-ELISA(V)方法进行验证,表明其具有良好的敏感性、特异性和重复性。用PRRSV不同毒株人工感染不同日龄的猪,于感染后定期采集血液、鼻拭子样品,并在猪死亡或被处死后解剖、采集组织脏器,用所建立的三种NASBA-ELISA方法和商品化RT-PCR试剂盒检测这些样品。结果显示,NASBA-ELISA和RT-PCR结果的符合率为83.91%(219/261),且NASBA-ELISA(C)和NASBA-ELISA(V)能准确地区分PRRSV经典毒株和变异毒株;NASBA-ELISA检测血液样品、鼻拭子样品和组织样品的阳性检出率均高于RT-PCR,表明NASBA-ELISA的检测敏感性高于RT-PCR;NASBA-ELISA检测血液样品比检测鼻拭子样品敏感,表明血液比鼻拭子更适合作为NASBA-ELISA检测PRRSV的样品。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
缩略词中英文对照表  5-7
第一章引言  7-16
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构  7-8
  1.2 我国流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因组变异情况  8-9
  1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术研究进展  9-11
  1.4 核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)研究进展  11-15
  1.5 本研究的目的与意义  15-16
第二章 NASBA-ELISA方法的建立  16-42
  2.1 材料  16-18
  2.2 方法  18-22
  2.3 结果  22-37
  2.4 讨论与小结  37-42
第三章 NASBA-ELISA与RT-PCR的应用比较  42-51
  3.1 材料  42
  3.2 方法  42-43
  3.3 结果  43-49
  3.4 讨论与小结  49-51
结论  51-52
参考文献  52-58
致谢  58

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株和变异毒株NASBA-ELISA鉴别诊断方法的建立及应用

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