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金鱼PP2A-B″家族调节基因的cDNA克隆及mRNA表达分析

作　者: 郑春兵
导　师: 李万程
学　校: 湖南师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: PP2A 调节亚基B″家族 cDNA克隆序列分析 mRNA表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

蛋白质磷酸化和去磷酸化是真核生物体内基本的调控机制。蛋白磷酸酶行使的去磷酸化作用在调控细胞内各种生命过程中起了重要的作用。PP2A是主要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶之一,而其众多的调节亚基在PP2A发挥功能时起着重要的作用。本论文中,以金鱼卵巢组织作为实验材料,运用RT-PCR技术和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆得到蛋白磷酸酶2A（PP2A）调节亚基B″家族中alpha（PR130）基因cDNA部分序列和beta（PR67）基因、gamma（G5PR）基因cDNA全序列。结果显示α基因cDNA长1781bp,编码的多肽共含有426个氨基酸,系α亚基的部分蛋白序列,β基因cDNA长2561bp,编码的蛋白质共含有581个氨基酸,而γ基因cDNA全长1885bp,编码一个含有457个氨基酸的蛋白质。比较分析发现,三个调节亚基与已知其他物种对应的B″家族调节亚基均有着很高的同源性,分别达到68.3%、52.9%和83.6%,说明三个调节基因在物种间的进化上比较保守。PP2A-B″家族成员间的氨基酸序列比对结果显示,与PP2A-B″调节基因γ相比,PP2A-B″调节基因α与β间具有更高的相似性,暗示α与β两调节基因在行驶功能时具有一定的相关性,而γ的作用方式与α和β有较大差异。结构预测分析显示,α、β、γ三条多肽均存在PP2A调节亚基B″家族成员共有的两个EF-HAND基序,位于调节亚基的C端。将三个亚基与三聚体PP2A/B′γ1装配模型中的调节亚基B′γ1作氨基酸序列比对,发现在PP2A全酶装配中起重要作用的B′γ1 HEAT-like重复结构中的特定残基在B″家族调节亚基中并不保守,提示B″家族调节亚基中的EF-HAND基序可能与B′γ1中的HEAT-like重复结构存在功能上的相似性,在三聚体PP2A的装配中起重要作用。另外,EF-HAND基序也可能作为Ca²⁺调控的调节元件参与对PP2A-B″家族蛋白功能的调节。用RT-PCR半定量的方法检测了PP2A-B″α、β、γ三个调节基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平。结果表明,α、β两亚基的表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,α亚基在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最底,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强;β亚基的表达结果与α亚基相似,在卵巢中最强,在精巢中次之,也同样在腮中的表达量最低,不仅如此,β亚基与α亚基在金鱼胚胎表达方面更加相似;与α、β两亚基表达模式相比,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达,且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中相对丰富。据此,我们推测PP2A-B″α、β、γ三调节亚基可能在金鱼不同组织中和胚胎发育不同时期中起着特定的作用,尤其值得注意的是,PP2A-B″家族基因可能在金鱼生殖腺的发育或生殖细胞的成熟中具有重要作用。此外,结合PP2A-A和PP2A-C的表达情况,进一步的分析发现,α、β两基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的生物学功能。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
前言  9-17
  1 蛋白磷酸酶-2A(PP2A)  10-14
    1.1 PP2A的结构  10-11
    1.2 PP2A的功能  11-14
  2 PP2A调节亚基B″家族成员概况  14-17
第一章金鱼PP2A-B″α、β、γ三个调节基因的cDNA克隆  17-33
  1 实验材料和方法  17-26
    1.1 实验材料  17
    1.2 实验方法  17-26
  2 实验结果  26-31
    2.1 金鱼PP2A-B″α基因的cDNA克隆  26-27
    2.2 金鱼PP2A-B″β基因的cDNA克隆  27-29
    2.3 金鱼PP2A-B″γ基因的cDNA克隆  29-31
  3 讨论  31-33
第二章金鱼PP2A-B″α、β、γ三个调节基因的序列分析  33-41
  1 实验方法  33
  2 实验结果  33-38
    2.1 金鱼PP2A-B″α、β、γ三个调节基因的多肽分析  33
    2.2 金鱼PP2A-B″α、β、γ三个调节基因的多肽结构分析  33-34
    2.3 金鱼PP2A-B″α、β、γ三个调节基因的序列比对分析  34-38
  3 讨论  38-41
第三章金鱼PP2A-B″α、β、γ三个调节基因的mRNA表达分析  41-51
  1 实验材料与方法  41-44
    1.1 实验材料  41
    1.2 实验方法  41-44
  2 实验结果  44-47
    2.1 PP2A-B″α、β、γ在金鱼不同组织中的mRNA表达  44-46
    2.2 PP2A-B″α、β、γ在金鱼胚胎不同发育时期中的mRNA表达  46-47
  3 讨论  47-51
参考文献  51-58
附录  58-60
致谢  60-62

金鱼PP2A-B″家族调节基因的cDNA克隆及mRNA表达分析

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