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氯胺酮滥用大鼠脑内DA含量及D_2DRmRNA表达的变化研究

作　者: 刘美丽
导　师: 王玉瑾
学　校: 山西医科大学
专　业: 法医学
关键词: 氯胺酮大鼠脑多巴胺DA 多巴胺Ⅱ型受体mRNA 滥用
分类号: D919
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的研究长期腹腔注射不同剂量氯胺酮大鼠脑组织中单胺类神经递质多巴胺（DA）及其D₂受体mRNA的含量变化规律,以及与血中氯胺酮浓度的相关性;同时检测停药后鼠脑内两项指标的含量变化,并观察氯胺酮有无戒断反应,试图探究氯胺酮的成瘾性与脑内DA和D₂DRmRNA的关系。方法选用Wistar雄性大鼠模拟氯胺酮滥用环境,建立长期腹腔注射不同剂量氯胺酮的动物模型,120只雄性wistar大鼠随机分为四大组,分别选用0mg·kg ^-1（即生理盐水对照组）、10mg·kg ^-1、30mg·kg ^-1、60mg·kg ^-1为对照、低、中、高四个剂量组。每天早上7:00按体重腹腔注射一次,制备大鼠氯胺酮滥用模型,对照组同样按体重给予生理盐水。四个剂量组又各分为五批,分别在染毒或给予生理盐水后45min、1周、2周、3周、3周停药3天后各处死一批大鼠（染毒组6只/批,三批;对照组6只/批）。并且观察大鼠给药后30min内的行为变化,以及停药后的反应。处死大鼠后提取心血和脑组织分别进行氯胺酮、DA和D₂受体mRNA的测定。1.血中氯胺酮分析方法:血清中添加内标SKF525A、碱化、乙酸乙酯萃取,气相色谱/质谱联用（GC/MS）全扫描定性,内标法、工作曲线法气相色谱（GC）定量分析血中氯胺酮。2.脑中DA分析方法:脑组织加入高氯酸匀浆离心,用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）对所取上清液定量分析脑中DA含量。3.脑中D₂受体mRNA分析方法:采用实时荧光定量PCR法对脑中D₂受体mRNA表达水平进行半定量测定。4.数据处理:采用析因实验设计方法,观察五个时间点四个剂量下主要指标的含量变化,并研究其相关性。结果1.用GC及GC/MS法测定血中氯胺酮,氯胺酮检测线性范围为0.2～40μg·mL^-1,最低检出限均为0.01μg·mL^-1,方法回收率为91.33%～92.88%,日内和日间RSD分别小于10%和15%;用HPLC-ECD法测定脑中DA及其代谢物,检测线性范围为25～1300ng·mL^-1,最低检出限均为0.02ng·mL^-1,方法回收率为88.65～113.84%,日内和日间RSD分别小于10%和15%;实时荧光定量PCR法得到的D₂受体的RNA（以下简写为D₂DRmRNA）扩增曲线拐点清楚,基线平而无上扬现象,且指数期曲线陡直。2.大鼠给药后血中氯胺酮浓度随着给药周期的延长有逐渐增加的趋势（P<0.05）,且停药三天后处死组大鼠血中仍能检出氯胺酮。3.相同周期条件下,高、中、低三个剂量组大鼠脑中DA和D₂DRmRNA含量之间均有显著性差异（P<0.05）。给予氯胺酮组大鼠脑内DA均较生理盐水对照组高,且DA含量顺序为30mg·kg^-1>10mg·kg^-1>60mg·kg^-1 >对照组（P<0.05）;D₂DRmRNA表达水平则表现出以正常对照组的倍数形式减少,且顺序为30mg·kg^-1<10mg·kg^-1<60mg·kg^-1<对照组（P<0.05）。4.在10mg·kg^-1和30mg·kg^-1剂量下,氯胺酮对脑内DA和D₂DRmRNA含量存在剂量相关性,相关系数r值平均达到0.752和-0.806。而60mg·kg^-1组却并不符合这个趋势。5.相同剂量条件下,10mg·kg^-1和30mg·kg^-1组大鼠在给药45min、1周、2周、3周后,脑内DA含量均较生理盐水对照组高,且呈现逐渐递增的趋势（P<0.05）;D₂DRmRNA表达水平均较对照组低,且呈逐渐减少趋势（P<0.05）。3周后停药三天大鼠脑内DA含量较2周、3周组有所减少,却仍比生理盐水对照组高（P<0.05）;D₂DRmRNA表达水平较2周、3周组略有回升,但仍低于对照组（P<0.05）。结论1.采用的测定血中氯胺酮GC及GC/MS方法、脑中多巴胺HPLC-ECD方法、D₂DRmRNA的RT-PCR方法灵敏度高,重现性好,能够应用于氯胺酮、DA和D₂DRmRNA的定性定量分析。2.氯胺酮连续滥用后血中浓度逐渐增加,且停药三天后仍可检出,提示氯胺酮可能存在体内积蓄;长期服用可能造成肝肾损害,使氯胺酮半衰期延长。3.服用氯胺酮后脑内DA含量增高、D₂DRmRNA表达减少,可能原因是由于氯胺酮能通过增加DA释放量或阻断DA降解而使脑内DA含量增加;或者由于连续给药后,氯胺酮在体内积蓄,使得脑内DA含量逐渐增多。而D₂DR则由于不断受到过多的DA的刺激,其mRNA表达水平反射性减低。4.在10mg·kg-1～30mg·kg-1剂量下,氯胺酮与脑内DA和D₂DRmRNA含量存在剂量相关性,且随着给药周期的延长有逐渐递增和递减的趋势。而60mg·kg-1组大鼠脑内DA和D₂DRmRNA含量并没有随着给药周期的延长呈现递增或递减的趋势,而是保持在一定的水平,说明60mg·kg-1时血中氯胺酮浓度与脑内DA和D₂DRmRNA含量不存在剂量相关性,可能原因是高剂量氯胺酮对中枢麻痹作用增强,对边缘系统的兴奋作用削弱所致。5.根据中脑边缘多巴胺系统参与成瘾理论以及“奖赏不足综合症”假说,再结合本次实验得到的大鼠服用氯胺酮后脑内DA和D₂DRmRNA含量变化以及停药后两项指标的变化,可以得出DA和D₂DRmRNA可能与氯胺酮的成瘾性有关的结论。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
英文缩略词  10-11
正文  11-36
  前言  11-13
  第一部分氯胺酮、DA、D2DRm RNA 的检测方法  13-24
    1.1 GC/MS及GC法测定心血内氯胺酮浓度  13-17
    1.2 高效液相-电化学检测法（HPLC-ECD）测定脑中 DA 含量  17-20
    1.3 荧光实时定量 PCR 法（RT-PCR）测定脑内 D2DRmRNA 含量  20-24
  第二部分氯胺酮滥用大鼠脑内DA含量及D2DRmRNA表达的变化  24-34
    2.1 材料  24
    2.2 方法  24-26
    2.3 结果  26-30
    2.4 讨论  30-33
    2.5 结论  33-34
  参考文献  34-36
综述  36-45
  正文  36-42
  参考文献  42-45
个人简介  45-46
致谢  46

氯胺酮滥用大鼠脑内DA含量及D_2DRmRNA表达的变化研究

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