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纤维蛋白支架对成人鼻粘膜嗅鞘细胞生物学特性的影响

作　者: 陈静
导　师: 张志坚；龚爱华
学　校: 江苏大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 纤维蛋白支架人嗅鞘细胞生物相容性 2,3-环核-3-磷酸二酶髓鞘碱性蛋白神经营养因子脊髓损伤
分类号: R318.0
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究目的探讨成人嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,hOECs)的分离和纯化培养方法,并对其进行形态学研究,为治疗脊髓损伤提供新的细胞来源;探讨纤维蛋白支架对成人鼻粘膜嗅鞘细胞生物学特性的影响,包括对人嗅鞘细胞髓鞘相关蛋白表达的影响,以及对人嗅鞘细胞的神经营养因子表达的影响。同时构建hOECs/纤维蛋白组织工程支架,为神经再生寻找新的移植供体,为hOECs/纤维蛋白组织工程支架移植修复脊髓损伤提供可行性研究资料。研究方法取自愿者(成人)的嗅粘膜,在体外采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅粘膜细胞,跟踪观察细胞的形态变化,并行神经生长因子受体(nerve growthfactor receptor p75,NGFRp75),胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein,GFAP)及S-100免疫荧光染色鉴定。用培养基将纤维蛋白原制成胶状溶液,在凝血酶的促凝作用下,使其凝固成多孔的纤维蛋白支架。显微镜观察支架的表面结构,并用电子显微镜观察支架内部的三维结构。将体外培养的成人鼻粘膜嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架,用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照底物,培养14天后用扫描电镜观察细胞的形态学变化并对细胞内髓鞘形成相关蛋白2,3-环核-3-磷酸二脂酶(2’,3’-cyclic nucleotide-3’-phosphodiesterase,CNPase)和髓鞘碱性蛋白(myelinbasic protein,MBP)进行免疫荧光染色定位和免疫印迹半定量测定,分析纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞CNPase和MBP表达的影响。在纤维蛋白(fibrin)支架表向种植成人嗅粘膜来源的嗅鞘细胞。倒置显微镜下观察其生长增殖情况和突起长短,并与种植在玻璃片上的嗅鞘细胞相比较。培养后一周,应用免疫荧光染色鉴定成人嗅鞘细胞,观察神经营养因子的表达情况。采用免疫印迹比较分别生长于支架上和玻璃片上的嗅鞘细胞合成神经营养因子的能力。实验结果嗅粘膜培养出三种细胞:梭形细胞、双极细胞和三极细胞。其中绝大部分梭形和双极细胞呈NGFRp75、GFAP和S-100阳性。纤维蛋白支架呈半透明多孔海绵状,质地柔软有弹性。支架纵切面经伊红染色后用光镜观察,支架内部呈多孔的网状结构。用扫描及透射电镜观察,支架具有三维多孔网状结构。人嗅鞘细胞种植于纤维蛋白支架后,其形态为长条带状,细胞成束排列,方向一致。细胞内CNPase和MBP表达水平明显高于对照组。人嗅鞘细胞在纤维蛋白支架上贴壁良好,增殖旺盛,伸出较长的突起。生长于支架上的嗅鞘细胞较玻璃片上的细胞合成更多的神经营养素。实验结论成人嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养可获得较高产量的嗅鞘细胞,该细胞可作为自体细胞移植治疗中枢神经系统损伤的候选细胞。纤维蛋白支架外观半透明具有较好的韧性,具有三维多孔网状结构,纤维蛋白作为生物材料用于构建修复脊髓损伤的组织工程支架具有良好的应用前景。纤维蛋白支架与人嗅鞘细胞具有很好的生物相容性并可促进细胞表达髓鞘相关蛋白CNPase和MBP;将该组织工程支架用于移植治疗脊髓损伤,有利于再生神经纤维的髓鞘形成。纤维蛋白支架能促进人嗅鞘细胞增殖,同时促进嗅鞘细胞神经营养素分泌,包括神经生长因子(nerve grow factor,NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养素-3(Neurotrophin-3,NT-3)。将该组织工程支架用于移植治疗脊髓损伤,有利于神经纤维的再生。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-14
引言  14-18
第一章成人嗅鞘细胞的获取及其体外培养和鉴定  18-30
  1.1 实验材料和方法  21-23
    1.1.1 实验材料  21-22
    1.1.2 实验方法  22-23
  1.2 实验结果  23-26
  1.3 讨论  26-30
第二章纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞形成髓鞘相关蛋白的影响  30-39
  2.1 纤维蛋白支架的构建  32-33
    2.1.1 实验材料和方法  32
    2.1.2 实验结果  32-33
    2.1.3 实验结论  33
  2.2 纤维蛋白支架接种人嗅鞘细胞  33-39
    2.2.1 实验材料和方法  33-35
    2.2.2 实验结果  35-37
    2.2.3 讨论  37-39
第三章纤维蛋白支架对人嗅鞘细胞神经营养因子表达的影响  39-44
  3.1 实验材料和方法  39-41
  3.2 实验结果  41-42
    3.2.1 支架上嗅鞘细胞神经营养因子的免疫荧光染色结果  41
    3.2.2 支架上嗅鞘细胞神经营养因子表达水平的免疫印迹检测  41-42
  3.3 讨论  42-44
第四章总结及工作展望  44-46
致谢  46-47
参考文献  47-55
论文发表附录  55-56
综述  56-63
  参考文献  62-63

纤维蛋白支架对成人鼻粘膜嗅鞘细胞生物学特性的影响

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