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戊型肝炎流行病学调查与ORF2基因真核表达载体的构建及免疫效应研究

作　者: 刘俊峰
导　师: 李培锋；华修国
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 戊型肝炎斑点杂交 RT-nPCR Overlap-PCR 间接免疫荧光免疫印迹
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

戊型肝炎(Hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)引起的一种人和多种动物的人兽共患病。本论文首次应用斑点杂交(Dot-bot)技术确证了抗-HEV抗体IgG在宠物狗中的分布情况,并且以猪源HEV病毒的结构蛋白基因(ORF2)为切入点,成功构建了结构蛋白基因真核表达载体,且系统的研究了ORF2基因在细胞中的表达情况,以及对BaLB/c小鼠免疫效应。目的:构建猪戊型肝炎病毒ORF2基因的真核表达载体PCDQL和PCDPL,并在COS-7细胞中进行表达。通过肌肉注射与饱和蔗糖联合免疫Balb/c小鼠,检测其产生的免疫应答水平,期望通过基因疫苗作用使小鼠对戊肝病毒产生免疫防御能力。方法:运用双抗原夹心ELISA方法(DS-ELISA)检测宠物狗血清样品中HEV抗体,并且运用Dot-bot方法排除假阳性的存在。用RT-nPCR和Overlap-PCR的方法扩增ORF2全基因和其C端序列,将PCR产物纯化后插入pcDNA3.1(+)载体,构建重组质粒,将重组质粒PCDQL和PCDPL转化入感受态细胞DH5α进行大量复制。转染COS-7细胞,用免疫细胞化学和免疫印迹验证其在真核细胞得到表达后,将重组质粒、对照空质粒pcDNA3.1(+)及生理盐水分组通过肌肉注射免疫6周龄Balb/C雌鼠,隔两周免疫一次,共免疫3次。初免后每隔2周采用ELISA间接法测定小鼠血清中抗HEV IgG抗体水平。结果:检测结果显示,宠物狗总体阳性率约12.0%,其中OD值最高为2.5,最低为0.01,临界值为0.13,结果表明HEV在江浙地区宠物狗中有一定的流行,可能在HEV传播中起到重要作用;在所构建的真核表达质粒中,PCDQL能够很好的诱导机体产生免疫反应,免疫4周后约90%的小鼠产生抗-HEV抗体,重组质粒PCDPL也能诱导机体产生免疫反应,在免疫4周以后约有25%的小鼠产生抗-HEV抗体。与对照组差异显著(P<0.05)。结论:(1)斑点杂交试验结果证实宠物狗血清中存在HEV抗体,为HEV在跨种间传播的研究提供了实验依据。(2)成功克隆了猪戊型肝炎病毒ORF2基因和其C端序列。(3)构建的PCDQL和PCDPL真核表达载体能在真核细胞中表达,且可诱导小鼠产生免疫应答。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 前言  8-19
  1.1 分子病原学  8-9
  1.2 分子生物学  9-11
    1.2.1 基因组结构  9-10
    1.2.2 病毒编码蛋白  10-11
  1.3 基因型和血清型  11-12
  1.4 HEV 的体外细胞培养  12-13
  1.5 流行模式与地理分部  13-14
  1.6 临床特征与免疫反应  14-15
  1.7 发病机理  15
  1.8 实验室检测方法  15-17
    1.8.1 免疫电镜  15
    1.8.2 免疫荧光检测法  15-16
    1.8.3 RT-nPCR  16
    1.8.4 免疫印迹  16
    1.8.5 酶联免疫吸附实验  16-17
    1.8.6 血清中和试验  17
  1.9 预防与疫苗研究  17-18
  1.10 问题与展望  18-19
  1.11 本研究的目的和意义  19
2 实验内容  19-53
  2.1 宠物狗血清中戊型肝炎病毒抗体检测  19-24
    2.1.1 材料与方法  19-21
    2.1.2 结果与分析  21-23
    2.1.3 讨论  23-24
  2.2 ORF2 基因真核表达载体的构建及其免疫效应研究  24-53
    2.2.1 材料与方法  24-39
    2.2.2 结果与分析  39-49
    2.2.3 讨论  49-53
3 结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-61
附录  61-65
作者简介  65

戊型肝炎流行病学调查与ORF2基因真核表达载体的构建及免疫效应研究

内容摘要

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