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Sox17对小鼠胚胎干细胞分化的影响

作　者: 曲学彬
导　师: 潘杰；张丛
学　校: 山东师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Sox17因子小鼠胚胎干细胞细胞分化原始内胚层终末内胚层
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

干细胞(Stem cell,SC)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,有很高的可塑性。在一定条件下,SCs可以分化成多种功能细胞,具有再生各种组织器官的潜在功能,医学界称之为“万用细胞”。胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)是受精卵分裂发育成囊胚时,内层细胞团(Inner cell mass)来源的细胞,其发育受多种内在机制和微环境因素的影响,大量的细胞因子通过复杂的网络联系对细胞的增值和分化进行调控,使之向指定的方向发展。目前,科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养多种动物的ESC,建立了相应的细胞系。ESC模型的建立,为体外研究胚胎发育过程中各种因子的作用机制奠定了基础。Sox(SRY-related HMG-box gene)因子属于HMG(high mobility group)-box转录因子家族的成员,在脊椎动物中高度保守,并在胚胎发育过程中发挥重要作用。作为Sox家族的一员,Sox17在内胚层发育过程中必不可少。利用基因打靶技术制备的Sox17基因突变(Sox17-/-)小鼠原肠发育严重受阻,并导致胚胎致死。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎外胚层异位表达Sox17基因,可引起其向内胚层分化。然而,目前对Sox17的研究还不深入(尤其在哺乳动物中),其在内胚层分化过程中的作用机制尚不明确。研究表明,在爪蟾中Sox17与Wnt信号通路中的关键因子β-catenin相互作用,从而引起下游基因的特异性转录。综上所述,针对Sox17因子的生物学功能及其作用机理的深入研究,将对阐明胚胎发育的基因调控机制,多种组织器官的发生发育过程和调控机制,以及临床多种畸形表型的发生机制等都具有十分重要的意义。本实验以小鼠ESC为研究对象,将鼠外源Sox17基因转入该细胞中,制备Sox17过表达模型,体外培养该细胞。以该细胞为研究对象,通过细胞形态特征、半定量RT-PCR和免疫组织化学等手段检测其分化过程中的各项指标(细胞水平、分子水平),研究Sox17在ESC分化过程中的功能,以期进一步探讨其影响内胚层分化的作用机制。本实验结果显示:1.带有鼠源Sox17基因的质粒载体pPyCAGIP通过Lipofectamine 2000转染小鼠ESC E14/T,外源Sox17基因的转染率大约为40%-50%。2.与阴性对照(空载体转染的细胞)相比,Sox17转染的细胞在有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)存在的培养基中逐渐分化:细胞群落由集中变为分散;干细胞多能性标志基因Oct4,Rex-1表达水平明显下降。3.与阴性对照相比,Sox17转染的细胞原始内胚层标志基因Gata4,Gata6,Hnf1β,体壁内胚层标志基因LamininB1(LamB1),Thrombomodulin(TM),Disabled homolog2(Dab2),Sparc表达上升。表明Sox17诱导ESC向原始内胚层分化。4.ESC在去除LIF的培养基中悬浮培养形成拟胚体(Embryoid body,EB)。在EBs的第二天、第六天及第十天,与对照组细胞相比,转染了Sox17的EBs中原始内胚层标志基因Gata4,Gata6,Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factorⅡ(Coup-tfⅡ),体壁内胚层标志基因LamB1,TM,Dab2,Sparc和脏壁内胚层标志基因Alpha fetoprotein(Afp),Bone morphogenetic protein 2(Bmp2)表达上调。终末内胚层标志基因Intestinal fatty acid binding protein(Ifabp),Pancreatic and duodenal homeobox 1(Pdx-1),中胚层标志基因Actc表达上升。另外,Wnt信号通路关键因子β-catenin表达水平增加。说明Sox17诱导EBs向原始内胚层及终末内胚层分化。综上所述,Sox17可能与β-catenin共同作用,在ESC发育过程中发挥着双重的作用:初期可诱导ESC向原始内胚层分化;随着ESC发育到EB阶段,Sox17不仅促进原始内胚层分化,而且还诱导终末内胚层的分化,从而影响内胚层起源的器官(如肝脏、胰腺等)的形成。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
缩写词  9-11
综述  11-32
  1. 干细胞简介  11-12
  2. 胚胎干细胞简介  12-23
    2.1 胚胎干细胞的形态学特征  12-13
    2.2 胚胎干细胞的研究现状及应用  13-17
    2.3 胚胎干细胞的发育调控  17-23
  3. 诱导多能干细胞（iPSC）简介  23-25
  4. Sox 基因简介  25-31
    4.1 基因的发现  26
    4.2 Sox 基因的一般特点  26-27
    4.3 基因的功能  27-29
    4.4 Sox17 简介  29-31
  5. 研究展望及本实验开展意义  31-32
正文  32-61
  第一部分小鼠胚胎干细胞的培养及转染  32-46
    1. 材料与试剂  33-35
    2. 仪器与设备  35-36
    3. 方法步骤  36-41
    4. 实验结果  41-43
    5. 分析与讨论  43-46
  第二部分 Sox17 对小鼠胚胎干细胞分化的影响  46-60
    1. 材料与试剂  46-48
    2. 仪器与设备  48-49
    3. 方法步骤  49-52
    4. 实验结果  52-58
    5. 分析与讨论  58-60
  小结  60-61
参考文献  61-72
攻读硕士学位期间发表的学术论文  72-73
致谢  73

Sox17对小鼠胚胎干细胞分化的影响

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