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神经元Nogo-A分子信号与功能的初步研究

作　者: 戴金祥
导　师: 鞠躬；金卫林
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Nogo-A NF-κB proline rich结构域 HEK293FT细胞 PC12细胞分化
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 60次
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内容摘要

髓鞘来源的中枢神经再生抑制因子—Nogo-A自2000年被克隆以来,其抑制神经再生的机制已经被广泛研究。现在知道,寡突胶质细胞上表达的Nogo-A通过神经元表面的NgR/ p75NTR(或者TROY)/LINGO-1受体复合物抑制神经元突起的生长。虽然目前有很多实验室利用在体和体外干预实验来封闭与Nogo相关的抑制信号,并取得了比较显著的神经突起生长和神经再生。但是,2003年Schwab、Strittmatter和Tessier-Lavigne三家实验室利用不同的基因敲除策略进行了Nogo基因剔除的实验,并没有得到一致证据支持Nogo与中枢神经再生的直接关系。在中枢神经系统中,Nogo-A不仅高表达于成熟的少突胶质细胞,而且在多种类型的神经元中也广泛表达。我们实验室以前的研究显示神经元表达的Nogo-A蛋白除少量定位于细胞膜上,主要定位于内质网、多聚核糖体和细胞核内的染色质上,提示Nogo-A可能与某些神经元的功能有关。通过Nogo-A蛋白的一级结构分析发现,Nogo-A的氨基端不仅存在潜在的核进入位点,还富含酸性氨基酸和多个可能与很多带WW、SH3结构域的信号分子相互作用的脯氨酸丰富(Proline Rich)结构,提示Nogo-A很有可能作为重要的调节蛋白参与神经元中的转录调控。作为揭示Nogo-A神经元功能的系列研究的一部分,本课题主要以人胚胎肾细胞系HEK293FT为模型来研究Nogo-A可能调节的下游转录信号及其机制,并在此基础上利用PC12细胞分化模型初步研究Nogo-A对神经元分化和突起生长的调节作用。主要获得的结果如下:(一)在HEK293FT细胞系中,利用信号途径报告基因系统筛选过表达Nogo-A对多种信号途径的调控作用时,发现Nogo-A能特异激活NF-κB信号,并且Nogo-A对NF-κB信号的激活是Nogo-A剂量依赖的。(二)利用不同的Nogo-A剪接体和截断体形式研究证明Nogo-A激活NF-κB信号依赖于其氨基端的Proline Rich结构域。(三)进一步使用NF-κB信号途径相关分子显性突变体揭示IκBα、TRAF6、Rac/Cdc42参与Nogo-A激活NF-κB信号。(四)利用纯化的GST-NogoA截断体蛋白胞外作用HEK293细胞,发现它们对细胞内的NF-κB活性没有明显的影响,提示Nogo-A对NF-κB信号的激活不是通过分泌到细胞外的蛋白片段作用于相应受体介导的。(五)利用RNAi技术下调PC12细胞中Nogo-A的表达,可以有效的抑制NGF诱导PC12细胞分化过程中NF-κB信号的激活。(六)观察到在PC12细胞中瞬时过表达NogoA,NGF诱导3天后发现过表达Nogo-A对NGF诱导PC12分化和突起生长并没有影响;我们同时构建了稳定表达PMIR-Nogo-A和对照载体PMIR-Control的PC12细胞系,NGF诱导后发现下调PC12中Nogo-A的表达对NGF诱导PC12分化也没有影响。结果提示,Nogo-A可以显著的激活NF-κB信号,且依赖于Nogo-A氨基端的Proline Rich结构域和IκBα、TRAF6、Rac/Cdc42等信号分子的参与。虽然初步的研究显示Nogo-A对NGF诱导PC12分化和突起生长并没有显著影响,但Nogo-A-NF-κB信号的发现为深入研究神经元中Nogo-A蛋白的功能和信号提供了一个重要的切入口。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-13
英文缩写列表  13-14
文献综述  14-33
  1 Nogo 在中枢神经再生抑制中的作用  14-17
  2 Nogo 基因敲除和轴突再生  17-18
  3 Nogo-A 在神经元的表达和作用  18-21
  4 RTN 家族分子的功能和相关疾病  21-33
实验部分  33-60
  前言  33
  1 材料和方法  33-41
    1.1 材料  33-34
    1.2 方法  34-41
      1.2.1 PCR 扩增和基因克隆  34-35
      1.2.2 Nogo-A 不同截断体的构建  35-36
      1.2.3 Nogo-A RNA 干扰系统  36-37
      1.2.4 HEK293 细胞培养、细胞转染和Luciferase 分析  37
      1.2.5 蛋白抽提和Western Blotting  37-38
      1.2.6 GST 融合蛋白表达和纯化  38-39
      1.2.7 PC12 细胞的培养、转染和分化观察  39-41
  2 实验主要结果  41-56
    2.1 Nogo-A 可以显著激活NF-κB 报告基因，但不激活GRE、HSE、CRE 等其他报告基  41-42
    2.2 Nogo-A 特异激活NF-κB 信号  42-44
    2.3 Nogo-A 对NF-κB 信号的激活是Nogo-A 剂量依赖的  44-45
    2.4 Nogo-A 激活NF-κB 信号依赖于其N 端特异的Proline Rich 结构域  45-46
    2.5 Nogo-A 激活NF-κB 活性的下游信号  46-47
    2.6 Nogo-A 截断体融合蛋白胞外作用HEK293 细胞对NF-κB 活性的影响  47-50
    2.7 Nogo-A 对NGF 诱导PC12 分化过程中NF-kB 信号的影响  50-52
    2.8 Nogo-A 对NGF 诱导PC12 分化和突起生长的影响  52-56
  3 讨论  56-60
    3.1 Nogo-A 依赖proline rich 结构特异激活NF-kB 信号  56
    3.2 Nogo-A 激活NF-kB 信号需要TRAF6，Rac/Cdc42 等信号分子的参与  56-57
    3.3 Nogo-A 在PC12 细胞分化和突起生长中的作用  57-58
    3.4 Nogo-A 激活NF-κB 信号可能参与神经元的生理和病理功能  58-60
研究的小结和展望  60-62
参考文献  62-72
攻读学位期间已发表或录用的论文  72-73
致谢  73-74
上海交通大学硕士学位论文答辩决议书  74

神经元Nogo-A分子信号与功能的初步研究

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