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接头蛋白TRAF与CKIP-1、Smurf1的相互作用及功能研究

作　者: 李珊
导　师: 安利国；贺福初；张令强
学　校: 山东师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 接头蛋白TRAFs CKIP-1 泛素连接酶Smurf1 蛋白-蛋白相互作用 NF-κB
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


Smurf1(Smad ubiquitination regulatory factor 1)是HECT类泛素连接酶(E3)Nedd4家族中的成员之一,主要介导成骨细胞中BMP信号通路中蛋白分子的降解。Smurf1最早于1999年在寻找Smad1相互作用分子时被克隆,它是发现的第一个可以降解Smads的E3,这使得TGF-β/BMP通路与泛素-蛋白酶体降解通路联系起来。除Smad外,近期研究表明生理条件下,Smurf1特异泛素化降解磷酸化形式的MEKK2,从而负调控MEKK2-JNK-AP-1通路,抑制成骨细胞分化。酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1 (casein kinase 2 interacting protein-1, CKIP-1)是一个含PH结构域的质膜定位蛋白。2008年本实验室发表在Nature Cell Biology的文章揭示CKIP-1是Smurf1 E3活性的增强分子。Smurf1的两个WW结构域结合底物,而中间的连接区结合CKIP-1,因此CKIP-1、Smurf1、底物(如Smad1/5)之间就形成了“调控分子-E3-底物”三元复合物,CKIP-1增强Smurf1与底物的亲和力,加速底物泛素化。这是首次发现Smurf1的调控分子。TRAF(TNF receptor associated factor)家族分子作为胞内接头蛋白,能介导TNF受体、Toll样受体和IL-1受体超家族成员与多种下游信号通路包括NF-κB和JNK通路的信号转导,进而参与骨代谢、先天性和获得性免疫、胚胎发育、应激响应等多种生物学过程。与TRAFs结合的蛋白都含有一个或多个TRAF相互作用模序(TRAF-interacting motif, TIM)。CKIP-1中含有多个TIM模序,本文用免疫共沉淀技术证明了TRAFs与CKIP-1间的相互作用,其中TRAF1、TRAF4与CKIP-1结合较强,随后确定了TRAFs与CKIP-1结合的区域为C-TRAF结构域。通过报告基因实验表明,过表达CKIP-1可以上调NF-κB的转录活性。在研究TRAFs与CKIP-1相互作用的同时,本实验室利用酵母双杂交技术,以Smurf1介导底物结合的WW结构域(236-340aa)为诱饵蛋白,从成人脑文库中筛选到TRAF4(1-363aa)为候选相互作用蛋白。进而我们利用免疫共沉淀及GST pull-down技术,证明Smurf1与TRAF4可直接相互作用,这种相互作用是由Smurf1的WW2结构域及TRAF4的PY模序介导的。蛋白水平分析及体内泛素化实验表明,TRAF4是Smurf1的一个新的底物,且CKIP-1可以促进Smurf1对TRAF4的泛素化降解。随后的报告基因实验,也在NF-κB转录活性上进一步印证了Smurf1对TRAF4的依赖蛋白酶体的泛素化降解作用。综上结论,TRAF4与Smurf1、CKIP-1结合,符合CKIP-1促进Smurf1泛素化并依赖蛋白酶体降解底物的规律,进一步揭示了CKIP-1对Smurf1的E3调控具有普适性。目前关于CKIP-1、Smurf1在免疫信号通路中的功能及机制的认识仍很有限,本研究发现了Smurf1的一类新的底物,并为Smurf1、CKIP-1在免疫信号通路中的功能研究提供了新的证据。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-15
第一章 TRAF 与 CKIP-1 相互作用的研究  15-31
  第一节 TRAF 真核细胞表达载体的构建  15-19
  第二节 TRAF 与 CKIP-1 的相互作用  19-22
  第三节 TRAF1 与 CKIP-1 相互作用区域的确定及意义的探讨  22-27
  第四节 TRAF4 与 CKIP-1 相互作用区域的确定  27-31
第二章 TRAF 与 Smurf1 相互作用的研究  31-44
  第一节 TRAF4 与 Smurf1 的相互作用  31-35
  第二节 TRAF4 与 Smurf1 的相互作用区域的确定  35-40
  第三节 TRAF4 是 Smurf1 的新底物  40-44
讨论  44-47
参考文献  47-51
附录1 主要仪器设备和常用试剂的配制  51-54
附录2 英文缩写词  54-55
发表和投稿论文  55-56
致谢  56-57

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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