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Nutlin-1协同全反式维甲酸（ATRA）诱导白血病细胞分化的作用及其机制研究

作　者: 闫艳
导　师: 杨波；何俏军
学　校: 浙江大学
专　业: 药学
关键词: 细胞分化 ATRA Nutlin-1 MDM2 p-gp
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：全反式维甲酸(ATRA)是临床用于诱导肿瘤细胞分化的最重要的药物之一。但维甲酸耐药使其疗效降低,阻碍其临床的广泛应用。Nutlin-1为p53与其E3酶MDM2结合的抑制剂。本课题将探讨Nutlin-1与ATRA两药合用是否能够协同诱导白血病细胞的分化,初步研究其作用机制,并探索Nutlin-1的靶点MDM2在细胞分化过程中发挥的功能,希望为克服维甲酸耐药提供新思路。方法：选用三株白血病细胞株HL60 (p53缺失型)、NB4 (p53突变型)、U937 (p53野生型),探讨Nutlin-1协同ATRA诱导细胞分化的分子机制。(1)运用MTT法测定Nutlin-1对细胞的生长抑制作用,以及高浓度ATRA的细胞毒作用。(2)细胞经PI单染后,运用流式细胞术分析Nutlin-1诱导细胞凋亡的情况。(3)采用CDllb表面抗原的检测以及NBT还原实验观察ATRA单用或Nutlin-1与ATRA合用对细胞分化水平的影响。(4)运用小干扰RNA技术(siRNA技术)将U937细胞内p53沉默。(5)使用RT-PCR和Western Blot检测MDR1、c-myc、CEBP/β的mRNA水平和p-gp、RARα的蛋白水平。(6)流式细胞术检测细胞对染料JC1和Rhodamine123的外排作用。(7)通过ATP酶活性的测定以及分子docking模型观察Nutlin-1作为底物与p-gp的结合作用。以实体瘤细胞(骨肉瘤细胞U20S和神经母细胞瘤细胞CHP126)作为研究对象,探讨MDM2在ATRA诱导细胞分化过程中的作用。(1)通过细胞形态变化,细胞突触生长情况以及各分化分子标记物的表达水平检测CHP126细胞的分化情况：镜下观察并记录细胞的形态变化；运用Image Pro5.0软件分析并统计细胞突触的生长情况；Western Blot检测分子标记物MAP2和β3-tubulin表达水平的变化。(2)通过细胞增殖情况以及各分化分子标记物的表达水平检测U20S细胞的分化情况：采用细胞计数法检测其增殖情况；RT-PCR和Western Blot分别测定分子标记物ALP、RUNX2、OPN的mRNA和蛋白表达水平。(3)分别运用siRNA和小发卡RNA技术(shRNA技术)对细胞内MDM2和p53的蛋白表达进行沉默。(4)对细胞进行质粒转染,并建立稳定表达质粒PCMV-myc3-MDM2的CHP126和U20S细胞株。(5)运用RT-PCR以及Western Blot检测细胞内MDM2的mRNA以及蛋白水平。结果：MTT结果显示,相同浓度的Nutlin-1只有对p53野生型的U937细胞有生长抑制作用,对HL60、NB4和p53沉默的U937细胞株均无细胞毒作用。并且Nutlin-1(20μM)能够诱导U937细胞产生33.63%的凋亡率,而作用于其他细胞则无明显的凋亡现象。CDllb表面抗原的检测结果显示,在HL60细胞中,ATRA单用诱导细胞分化率为15.57%,而5μM、10μM、20μM Nutlin-1与之合用后,细胞分化率分别达到19.04%、21.83%、30.16%,呈现浓度依赖性。同样在NB4细胞中,Nutlin-1的这一作用更加明显。但在U937细胞中则观察不到Nutlin-1协同ATRA促分化的现象。NBT还原实验也说明了同样的实验结果。ATRA单用诱导HL60、NB4、U937细胞中NBT还原率分别为12.68%、46.20%、31.00%, Nutlin-1合用后NBT还原率则变为20.08%、83.06%、31.94%。同时我们将U937细胞中的p53沉默,Nutlin-1与ATRA依然没有合用效果。在ATRA处理HL60和NB4细胞过程中,p-gp的蛋白水平显著增高。并且MDR1的mRNA表达水平也呈现相同的上调趋势。然而这些变化在U937细胞中均不存在。之后我们用ATRA预处理HL60细胞1到3天,发现细胞对染料JC1和Rhodamine123的外排作用均逐渐增强。同时我们检测了高浓度ATRA (0-50μM)对NB4细胞的毒性作用,结果发现,已经使用0.01μM ATRA预处理3天的NB4细胞对ATRA的敏感性明显下降,但是当用经典的p-gp底物维拉帕米与ATRA合用时,高浓度ATRA的毒性作用则被部分逆转。在p-gp ATP酶活性实验中,Nutlin-1对酶活性的激活作用呈现浓度依赖性,而ATRA也显示为p-gp的底物。在此基础上,分子docking模型提示p-gp蛋白的特定氨基酸残基能够与Nutlin-1的两个异构体1a和1b结合。RT-PCR和Western Blot的结果分别显示,Nutlin-1与ATRA合用后能够明显抑制c-myc基因的表达,并显著增强C/EBPβ基因的激活,ATRA能够诱导其受体RARa蛋白的降解,而Nutlin-1合用后能够促使RARa蛋白水平下调的更加明显。在ATRA处理CHP126和U20S细胞1到3天过程中,MDM2蛋白水平明显下调,但是其mRNA水平保持不变。将MDM2沉默之后,ATRA作用5天能够显著诱导CHP126细胞突触增多增长,MAP2蛋白表达水平明显增高；在U20S细胞中,抑制MDM2的表达同样使其分化标记物ALP、RUNX2、OPN的表达上调,并且ATRA对细胞的生长抑制作用更加显著。在MDM2稳定高表达的CHP126和U20S细胞株中,结果则相反,即ATRA诱导细胞分化过程被抑制。将U20S细胞中p53沉默后,再将MDM2沉默,发现ATRA依然能够诱导分化标记物RUNX2和OPN蛋白水平的上调,说明MDM2对分化发挥的负性调控作用为p53非依赖性的。结论：Nutlin-1与ATRA有协同诱导白血病细胞分化的作用,与p53的功能状态无关。同时我们证明了Nutlin-1为p-gp的底物能够竞争性与其结合,从而抑制细胞对ATRA的外排,增强其下游通路的激活。作为Nutlin-1的靶点,MDM2在ATRA诱导CHP126和U20S细胞分化过程中发挥负性调控作用,并且MDM2这一功能为p53非依赖性的。本课题证实了Nutlin-1确实能够增强ATRA诱导细胞分化的能力,并初步探索其机制,为Nutlin-1在临床更广泛的应用和克服维甲酸耐药提供了实验依据。

Nutlin-1协同全反式维甲酸（ATRA）诱导白血病细胞分化的作用及其机制研究

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