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巴西橡胶树HbMyb1基因和OPV-10_（390）连锁标记原位PCR定位的研究

作　者: 高和琼
导　师: 庄南生
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 橡胶树 HbMyb1基因 抗白粉病基因连锁标记OPV-10390 原位PCR 染色体定位 核型分析
分类号: S794.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 78次
引　用: 4次
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内容摘要


本研究采用原位PCR技术对橡胶树死皮病抗性相关HbMyb1基因和抗白粉病基因连锁标记OPV-10390进行了物理定位,结果如下:成功地建立了橡胶树染色体原位PCR技术体系。该原位扩增的PCR反应液总体积为50μl,各反应组分的终浓度为:1×buffer,4.5 mM MgCl2,0.5 mg/ml BSA,200μM的dATP、dCTP、dGTP,72μM的dTTP,4μM DIG-11-dUTP,5U/5μl的Taq DNA聚合酶,2.4μM的Primer;原位PCR扩增程序为:95℃预变性后进行20个循环反应,94℃变性30S,53℃（视引物Tm值）退火1min,72℃延伸70S,最后72℃继续延伸7min;扩增后的洗脱为0.1×PBS 4～5 min,0.1×SSC/（吐温20）2×5min。利用本研究所建立的原位PCR技术,首次对橡胶死皮病抗性相关HbMyb1基因和抗白粉病基因连锁标记OPV-10390进行了染色体定位。在热研7-33-97和RRIM600叶片细胞不同分裂时期均扩增到1～2个信号。橡胶HbMyb1基因初步定位于7-33-97的第5号染色体长臂上,信号位点到着丝粒的百分距离为15.21。橡胶抗OPV-10390初步定位于RRIM600的第8号染色体长臂及11号染色体短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离分别是16.99、49.58。对热研7-33-97（RRIM600×PR107）和橡胶栽培品系RRIM600进行了核型分析。热研7-33-97的核型公式为2n=36=34m（4sat）+2sm,第15号染色体为亚中部着丝点染色体（sm）,其余17对染色体为中部着丝点染色体（m）,第6、7号染色体短臂具有随体,染色体绝对长度变化范围为3.14～6.36μm,相对长度为3.67%～7.44%,平均臂比为1.44,核型属2B型。RRIM600核型公式为2n=36=28m（4sat）+8sm,第11号、12号、14号及17号染色体为亚中部着丝点染色体（sm）,其余14对染色体为中部着丝点染色体（m）,第6、7号染色体短臂具有随体,染色体绝对长度变化范围为3.92～8.47μm,相对长度为3.45%～7.47%,平均臂比为1.60,核型属2B型。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
1 前言  10-26
  1.1 橡胶树种质概述  11
  1.2 橡胶树抗性相关基因研究概况  11-14
    1.2.1 死皮病抗性相关基因(HbMybl)  11-13
    1.2.2 含锰的超氧化物歧化酶基因(MnSOD)  13
    1.2.3 几丁质酶基因(Chitinase)  13
    1.2.4 抗白粉病基因连锁标记(OPV-10_(390))  13-14
  1.3 橡胶树基因定位研究进展  14-15
  1.4 橡胶树的核型分析  15-16
  1.5 植物原位PCR的研究进展  16-24
    1.5.1 原位PCR的基本原理  16-18
    1.5.2 植物原位PCR技术的主要操作步骤  18-23
    1.5.3 植物原位PCR应用进展  23-24
  1.6 本研究的目的意义和技术路线  24-26
    1.6.1 研究目的及意义  24-25
    1.6.2 研究的技术路线  25-26
2 材料与方法  26-37
  2.1 试验材料与试剂  26-27
    2.1.1 供试材料  26
    2.1.2 主要的仪器  26
    2.1.3 试剂  26-27
  2.2 试验方法  27-37
    2.2.1 橡胶树DNA提取  27-28
    2.2.2 特异引物合成与筛选  28-32
    2.2.3 橡胶树特异DNA序列的原位PCR检测体系  32-37
      2.2.3.1 PLL(L—多聚赖氨酸)包被玻片  32
      2.2.3.2 染色体标本制备  32-34
      2.2.3.3 预处理  34
      2.2.3.4 原位扩增  34
      2.2.3.5 荧光检测结果  34-35
      2.2.3.6 橡胶死皮病抗性相关基因HbMybl和抗白粉病基因连锁标记OPV—10_(390)的定位  35-37
3 结果与分析  37-55
  3.1 OPV-10_(390)特异引物的筛选  37-41
    3.1.1 橡胶树基因组DNA的提取  37
    3.1.2 橡胶树特异引物的合成与筛选  37-41
  3.2 橡胶树染色体的原位PCR技术体系的建立  41-46
    3.2.1 标本预理的优化  41-44
    3.2.2 原位扩增体系的建立  44
    3.2.3 扩增后洗脱的优化  44-46
  3.3 橡胶树HbMybl和OPV—10_(390)的原位PCR定位  46-55
    3.3.1 核型分析  46-52
    3.3.2.HbMybl在热研7-33-97叶片细胞不同分裂时期原位PCR及其染色体上的定位分析  52-53
    3.3.3 OPV—10_(390)在RRIM600叶片细胞不同分裂时期原位PCR及其染色体上的定位分析  53-55
4 讨论  55-60
  4.1 引物的筛选  55
  4.2 染色体标本制备及其保存  55-56
  4.3 预处理和洗脱强度  56-57
  4.4 原位PCR技术中的非特异性问题  57-58
  4.5 原位PCR定位时信号数量问题  58
  4.6 分析了热研7-33-97和橡胶RRIM600的核型  58-60
5 结论  60-61
参考文献  61-70
附录 试剂的配制  70-73
缩略语  73-74
致谢  74

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 特用阔叶树类 > 橡胶树
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