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模拟微重力下三维培养对人肝干细胞增殖和分化的影响

作　者: 姚新宇
导　师: 章莉莉
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科
关键词: 模拟微重力肝干细胞三维培养旋转式生物反应器微载体
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:肝干细胞是具有多向分化潜能的细胞,不仅可以从原始前肠内胚层及囊胚内细胞团中获得,也可以从胎儿、新生儿及成年肝脏中获得。体外培养可以形成细胞克隆,表达EpCAM, NCAM,ALB(albumin)+/-,CK(cytokeratins) 8,18 ,19,不表达AFP(α-fetoprotein)。在一定条件下可以分化为成肝细胞、肝细胞及胆管细胞。由于具有独特的干细胞特性,肝干细胞被认为是细胞治疗及生物人工肝治疗理想的种子细胞。如果能在体外大量扩增从而获得足够数量的细胞,那么肝干细胞将具有广阔的临床应用前景。目前,肝干细胞的培养大都采用传统的平面培养方法,即使细胞粘附于培养皿或培养瓶的底部,在静止环境中定期换液或传代。但这种培养方法可导致细胞一些关键性的表型及生物学功能消失,使细胞的生物学特性发生改变,显然不能满足肝干细胞扩增的要求。新近兴起的三维培养方法被认为更能模拟体内细胞环境,细胞的基因表达和生物学特性更接近于机体内的变化;其中,模拟微重力反应器即旋转式生物反应器(rotating cell culture system,RCCS)因为可以创造一个相对失重的、低剪切力、低紊流的三维培养环境,成为近年来应用于细胞研究的新手段之一。有学者将猪肝细胞置于模拟微重力反应器中培养21天后发现猪肝细胞仍能维持细胞形态和功能活性;小鼠胎肝细胞在模拟微重力反应器中可以形成类似肝组织样结构,其中包含成熟肝细胞、血管样及胆管样结构。也有学者应用特定的生物支架或三维灌注培养系统培养肝干细胞,发现可以促使肝干细胞向成熟的功能性肝细胞分化。新的细胞培养手段的应用,为我们深入了解肝干细胞生长特性创造了条件,也为我们建立和优化肝干细胞扩增技术带来了新希望。研究目的:本研究旨在既往肝干细胞研究的基础上,利用旋转式生物反应器可以营造失重状态的特点,进行模拟微重力下微载体三维培养肝干细胞,以肝干细胞平面培养及微载体培养作为对照,探讨微重力环境对肝干细胞生长增殖及分化的影响,为今后建立肝干细胞培养扩增系统提供依据。研究方法:从人胎肝组织中分离培养肝干细胞,进行肝干细胞鉴定;分别对肝干细胞进行常规平面培养、微载体培养、模拟微重力下微载体三维培养,利用倒置相差显微镜、扫描电镜观察肝干细胞形态学变化;通过对培养上清液中葡萄糖消耗量和乳酸脱氢酶含量的检测,比较三种培养方法中细胞生长增殖和细胞活性等情况,分析模拟微重力三维环境对肝干细胞生长增殖的影响;用荧光定量PCR法检测不同培养条件下肝干细胞ALB、EpCAM、CK19、AFP、HNF6、CYP3A4、CYP3A7mRNA表达变化,探讨模拟微重力下三维培养对肝干细胞分化的影响。研究结果:1.微载体培养条件下肝干细胞增殖方向可呈多向性,以包裹微载体形成复合物形式生长。模拟微重力三维培养条件下肝干细胞以微载体球面为基底,多向性增殖呈三维立体结构生长,可在倒置显微镜下观察到大小不等的与微载体连接紧密的细胞团,扫描电镜下见细胞团表面有丰富的细胞外基质及微绒毛,形成最大细胞团直径为100um以上。2.上清液葡萄糖消耗及LDH检测结果示:模拟微重力条件下肝干细胞从第9天开始葡萄糖消耗明显增加,至第17天达高峰,第21天明显下降;同时LDH含量直至第17天仍保持低水平,但第21天开始明显升高,与平面培养及微载体培养结果相比,有统计学差异;提示肝干细胞在模拟微重力环境中细胞生长起始期较长,进入生长对数期后细胞生长增殖能力远远强于平面培养及微载体培养的肝干细胞。当立体生长形成一定体积细胞团后,由于细胞团内部营养物质交换障碍,影响细胞进一步增殖。3.荧光定量RT-PCR检测结果:经过21天培养,模拟微重力下三维培养细胞高表达EpCAM、ALB、CK19、HNF6、CYP3A7,不表达AFP、CYP3A4;与微载体培养结果相比,模拟微重力环境中肝干细胞EpCAM、ALB、CK19、HNF6、CYP3A7的表达量分别是微载体培养的29倍、69倍、27倍、9倍和38倍,两者相比P值均小于0.05,具有统计学差异。提示模拟微重力三维培养环境中并没有发生肝干细胞分化;与微载体培养相比,模拟微重力环境更有利于肝干细胞维持细胞表型,从而能保持良好的干细胞特性。结论:1.模拟微重力环境能促进肝干细胞多向增殖呈三维立体结构生长;2.与平面培养和微载体培养相比,肝干细胞在模拟微重力环境中可以获得更强的细胞生长增殖能力及细胞活性;当肝干细胞生长形成较大细胞团后,营养物质交换障碍可影响细胞增殖;3.模拟微重力环境更有利于肝干细胞维持细胞表型,从而保持干细胞特性。4.模拟微重力三维培养技术优于微载体培养和平面培养,可以用于肝干细胞扩增,尤其适用于肝干细胞的短期扩增。

全文目录

英文缩略词  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-14
材料与方法  14-25
结果  25-35
讨论  35-38
结论  38-39
参考文献  39-42
综述  42-53
  参考文献  48-53
在校期间论文情况  53-54
致谢  54

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