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Atelocollagen胶原支架上三维培养乳鼠心肌细胞的实验研究

作　者: 滕伟
导　师: 郭志坤
学　校: 新乡医学院
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 三维培养 Atelocollagen胶原支架肌球蛋白心肌细胞乳鼠
分类号: R541
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的将培养的乳鼠心肌细胞种植到Atelocollagen胶原支架上。让种植的心肌细胞在三维支架上的生长分化成具有收缩功能的心肌组织块,为进一步开展心肌组织工程中奠定基础。方法1. 1 d的SD大鼠20只,无菌条件下取心室肌,消化、离心、培养,并应用差速贴壁法纯化心肌细胞,在培养基中加入Brdu(终浓度为0.01%mmol/L)抑制成纤维细胞的生长。心肌细胞培养24 h,观察其形态及生长状况,并取细胞爬片应用肌球蛋白免疫荧光染色鉴定心肌细胞。2.心肌细胞消化培养、纯化后,种植到Atelocollagen胶原支架上,进行三维培养。应用倒置显微镜动态观察心肌细胞在Atelocollagen胶原支架上生长情况。3.三维培养第10 d、20 d,对三维培养的心肌组织块进行石蜡包埋、切片,分别进行HE染色、肌球蛋白免疫组化染色、肌球蛋白免疫荧光染色、透射电镜观察,对三维培养的细胞进行全面鉴定。结果1.心肌细胞差速贴壁一次阳性率为78.4%,差速贴壁三次阳性率为86.3%,差速贴壁三次并在培养基中加入Brdu(终浓度为0.01% mmol/L)阳性率为92.4%,三种不同培养方法差异性(P<0.05),每两种不同方法比较也都有差异性(P<0.05)表明不同的差速贴壁次数和加入适当浓度的Brdu对心肌细胞纯化有作用。2.心肌细胞在Atelocollagen胶原支架上三维生长情况:倒置显微镜下看到,心肌细胞种植到Atelocollagen胶原支架后6 h开始贴壁生长,起初呈圆形,后呈梭形,偶见单个搏动心肌细胞。培养2 d心肌细胞与Atelocollagen胶原支架形成复合体,连同支架一起搏动,频率为18次∕min,律齐;培养4 d搏动频率为86次∕min,律齐;培养6 d搏动频率为126次∕min,律齐;培养8 d搏动频率为164次∕min,律齐;培养10 d搏动频率为146次∕min,律齐;培养10 d后细胞搏动频率随培养时间的延长而逐渐减慢,培养12 d搏动频率为122次∕min,律齐;培养14 d搏动频率为116次∕min,律齐;培养16 d搏动频率为106次∕min,律齐,培养20 d为78次∕min。3.心肌细胞与Atelocollagen胶原支架复合体HE染色显示:(1)培养10 d心肌细胞核明显,有多核现象,细胞与支架融合紧密,部分细胞融入支架中;(2)培养20 d未见细胞数目增多,细胞与细胞间结合较10 d时紧密,细胞核明显,有核固缩现象,可见横纹。4.肌球蛋白免疫组化染色可见心肌细胞肌球蛋白染色呈阳性反应;免疫荧光染色显示:DAPI标记阳性为细胞核,调整激发波,在细胞核周围可见大量点状、斑块状或线状的红色荧光,其为肌球蛋白表达。5.透射电镜观察结果:三维培养10 d的心肌细胞线粒体清楚,无明显水肿,无空泡化,肌丝生长不规则,心肌细胞与成纤维细胞结合并与支架融合;培养20 d的心肌细胞线粒体清楚,无明显水肿,肌丝生长较规则。结论1.多次差速贴壁比单次差速贴壁得到的心肌细胞纯度高,加入适当浓度的Brdu可抑制成纤维细胞的生长,获得纯度更高的心肌细胞;2.心肌细胞在体外三维培养时,可以形成相互融合的组织块,具有心肌组织的收缩性、自律性;三维培养的心肌细胞在8～20 d功能较好,细胞与细胞间的排列紧密,20 d以后,细胞功能减退。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
引言  11-13
1.材料与方法  13-30
2.结果  30-33
3.讨论  33-44
4.结论  44-45
附图  45-52
参考文献  52-56
综述1  56-68
  参考文献  65-68
综述2  68-76
  参考文献  74-76
攻读学位期间发表文章情况  76-77
致谢  77-78
个人简历  78

Atelocollagen胶原支架上三维培养乳鼠心肌细胞的实验研究

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