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重配制备甲型流感病毒Vero细胞高产株及无血清微载体培养流感病毒的研究

作　者: 张严予
导　师: 李卫东；姜述德；廖国阳
学　校: 北京协和医学院
专　业: 病原生物学
关键词: Vero细胞流感病毒重配无血清培养液微载体培养
分类号: R373.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

流行性感冒简称流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,能引起心肌炎、肺炎、支气管炎等多种并发症。接种疫苗是预防流感最有效的手段,流感疫苗以鸡胚为生产基质,有很多弊端,例如,难于在短时间内提供足够的鸡胚进行流感疫苗生产以应对流感爆发的需求。而以哺乳动物细胞为生产基质具有很大的优势,可采用发酵罐进行大规模的生产,易于质量控制。Vero细胞是WHO推荐用于人用疫苗生产的细胞基质,能够利用生物反应器进行大规模培养,在流感疫苗生产上有着广阔的应用前景。然而在Vero细胞培养流感病毒的过程中,因此需要在培养液中添加胰酶,常规细胞培养时残留的血清会导致胰酶失活。采用无血清培养细胞,可克服所含血清成分对病毒培养的干扰,还可消除培养时潜在污染源并利于分离纯化。微载体培养细胞提高了细胞和病毒的产量,使大规模培养成为了可能。本实验采用传统的流感病毒重配方法,获得含有疫苗株的表面抗原HA和NA基因且在Vero细胞上高产的毒株,在Vero细胞上连续传30代,观察其传代稳定性,并进行无血清微载体培养,为今后进行细胞流感疫苗打下基础。本课题研究包括以下两部分内容：一、重配制备甲型流感病毒HIN1Vero细胞高产株及传代稳定性以流感病毒Vero细胞高产株A/Yunnan/1/2005va (H3N2)为母本株,与WHO推荐的2007～2008年疫苗株A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)共同感染Vero细胞,用抗A/Yunnan/1/2005va (H3N2)血清筛选重配病毒,并经蚀斑纯化获得A/Solomn Islands/3/2006va(H1N1)。在Vero细胞上连续传10代建立工作种子批,通过基因测序,血凝抑制试验,免疫荧光试验,单向免疫琼脂扩散实验证明重配病毒含有A/Solomon Islands/3/2006毒株表面抗原HA和NA的基因。在Vero细胞上连续传代至30代,分别收获5代,10代,15代,20代,25代和30代的病毒,采用RT-PCR法扩增出重配流感病毒的HA和NA基因片段并测序,通过BioEdit软件进行基因序列比对分析,其HA和NA片段与A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)同源性达到了100%。重配获得的流感病毒H1N1 Vero细胞高产株即为A/Solomon Islands/3/2006va(H1N1),能够在Vero细胞上高产,且连续传代稳定性良好。二、无血清微载体培养甲型流感病毒条件的优化首先采用不同的细胞接种量在无血清微载体中片培养Vero细胞,选择适宜的细胞浓度。之后检测不同pH值,TPCK-胰酶含量,不同病毒接种量,补加TPCK-胰酶,以及不同收毒时间和收毒体积对血凝效价的影响。确定适宜的细胞接种浓度后,获得优化的无血清微载体培养甲型流感病毒条件：病毒培养液pH值为7.2～7.4范围内,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种后48h补加胰酶,病毒接种量MOI=1.0,并在72h一并收获全部培养体积的病毒液,Vero细胞最高血凝效价达到1024。筛选出无血清微载体培养Vero细胞接种流感病毒A/Solomon Islands/3/2006va(HlN1)Vero细胞高产株的适宜条件,为今后细胞流感疫苗的研发奠定基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
第一部分 A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)Vero细胞高产株的制备及传代稳定性研究  8-30
  前言  8-10
  一、实验材料  10-12
  二、实验方法  12-17
  三、结果和分析  17-26
  四、讨论  26-27
  五、小结  27-28
  参考文献  28-30
第二部分无血清微载体培养Vero细胞及A/Solomon Islands/3/2006va(H1N1)高产株的研究  30-41
  前言  30-32
  一、实验材料  32
  二、实验方法  32-33
  三、结果  33-36
  四、讨论  36-38
  五、小结  38-39
  参考文献  39-41
论文综述  41-51
  参考文献  48-51
附录  51-72
致谢  72-73
个人简历  73-74

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