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柠条锦鸡儿咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因cDNA和gDNA全长克隆及生物信息学分析

作　者: 张烨
导　师: 王瑞刚；李国婧
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 柠条锦鸡儿 拟南芥 CCoAOMT 木质素 过表达
分类号: S793.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


木质素是植物次生细胞壁的主要组成成分,它是一种在地球上含量丰富程度仅次于纤维素的高分子有机聚合物。木质素对植物本身和人类的生产、生活都有着重要的影响。咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是依赖S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基转移酶,在木质素生物合成过程中起到了重要的催化作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术首次从柠条锦鸡儿中克隆得到了两个编码CCoAOMT的cDNA序列和一个gDNA全序列,两个cDNA序列分别命名为CkCCoAOMT-C和CkCCoAOMT-G,推测它们都属于柠条锦鸡儿CCoAOMT基因家族,gDNA序列包含5个外显子和4个内含子。生物信息学分析结果表明:CCoAOMT-C与CCoAOMT-G都应属于亲水性蛋白,其分子量分别约为28,012.12D和27,970.08D,理论等电点分别为5.55和5.54;两个蛋白都由247个氨基酸残基组成,但在第125和134位氨基酸残基上存在差异,同样两者的二级结构和三级结构也存在不同程度的差异。CkCCoAOMT-C和CkCCoAOMT-G都具有Methyltransf3结构域和SAM结合位点,因此它们属于O-甲基转移酶家族。针对CkCCoAOMT-C和CkCCoAOMT-G两个基因构建过表达载体并转化野生型拟南芥,经筛选分别得到3个CkCCoAOMT-C转基因纯合体株系和6个CkCCoAOMT-G转基因纯合体株系。利用半定量RT-PCR检测转基因纯合体植株中目的基因表达量,发现所有株系中的目的基因均有不同程度的表达。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
1 引言  8-12
  1.1 木质素的生物学功能  8
  1.2 木质素的利用及影响  8
  1.3 木质素的生物合成概述  8-10
  1.4 咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）研究进展  10-11
  1.5 研究目的和意义  11-12
2 柠条锦鸡儿咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因全长克隆及生物信息学分析  12-34
  2.1 实验材料  12-13
    2.1.1 植物材料  12
    2.1.2 菌种  12
    2.1.3 试剂  12
    2.1.4 引物的合成及测序  12-13
  2.2 实验方法  13-21
    2.2.1 植物在营养土中的培养  13-14
    2.2.2 柠条锦鸡儿茎的RNA 提取及其DNA 的去除  14
    2.2.3 柠条锦鸡儿叶片基因组DNA 提取及RNA 的去除  14
    2.2.4 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因中间片段的克隆  14-17
    2.2.5 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因cDNA 3′末端的快速扩增  17-18
    2.2.6 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因cDNA 5′末端的快速扩增  18
    2.2.7 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因cDNA 全长的克隆  18-19
    2.2.8 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因gDNA 全长的克隆  19-20
    2.2.9 生物信息学分析  20-21
  2.3 结果与分析  21-34
    2.3.1 柠条锦鸡儿总RNA 电泳检测  21-22
    2.3.2 柠条锦鸡儿CCoAOMT 中间片段的克隆与测序结果分析  22-23
    2.3.3 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因cDNA 3′末端的扩增结果  23-24
    2.3.4 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因cDNA 5′末端的扩增结果  24
    2.3.5 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因cDNA 全长克隆结果  24-25
    2.3.6 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因gDNA 全长克隆结果  25-26
    2.3.7 核苷酸序列分析结果  26-29
    2.3.8 氨基酸序列分析结果  29-34
3 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因过表达转基因纯合体的获得与分子鉴定  34-42
  3.1 实验材料  34
    3.1.1 植物材料  34
    3.1.2 菌种和载体  34
    3.1.3 试剂  34
  3.2 实验方法  34-39
    3.2.1 拟南芥在营养土中的培养  34-35
    3.2.2 植物在培养皿中的无菌培养  35-36
    3.2.3 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因过表达载体的构建  36-37
    3.2.4 植物表达载体的农杆菌转化  37
    3.2.5 转基因植物的获得及纯合体的获得  37-38
    3.2.6 转基因植物的分子鉴定  38-39
  3.3 结果与分析  39-42
    3.3.1 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因过表达载体的构建  39
    3.3.2 pCHF3- CCoAOMT-C、pCHF3-CCoAOMT-G表达载体的农杆菌转化  39-40
    3.3.3 转基因植株的筛选  40-41
    3.3.4 转基因纯合体植株目标基因转录水平的半定量RT-PCR 检测  41-42
4 结论与讨论  42-45
  4.1 讨论  42-44
    4.1.1 柠条锦鸡儿CCoAOMT 基因克隆与生物信息学分析  42-44
    4.1.2 柠条锦鸡儿CCoAOMT 过表达转基因纯合体的获得  44
  4.2 结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-49
作者简介  49

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶灌木 > 柠条（中间锦鸡儿）
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