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副猪嗜血杆菌的分离与单抗制备及其抗原表位鉴定

作　者: 陈欣
导　师: 李曦
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌单克隆抗体 FeoB蛋白抗原表位噬菌体展示
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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引　用: 3次
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内容摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，可以引起猪的格拉瑟氏病。本病在猪群中可以引起猪的全身性疾病，如纤维素性多浆膜炎、脑膜炎、关节炎等疾病。副猪嗜血杆菌在各猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，并为世界范围的养猪业带来了巨大的经济损失。本研究从黑龙江某爆发格拉瑟氏病的猪场分离得到一株副猪嗜血杆菌的菌株命名为HLJ-018，并将HLJ-018全菌悬液作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用细胞融合技术，经过Westernblot和间接ELISA方法筛选阳性克隆后，获得了一株能够稳定分泌HPS的单克隆抗体（ＭAb）的杂交瘤细胞株2D2。单克隆抗体重链为IgG2a亚型，轻链为κ链。MAb 2D2特异性良好，可与HLJ-018菌株和外膜蛋白发生特异性反应。本实验通过对小鼠进行体内细菌清除试验发现，单克隆抗体2D2和多抗都具有细菌清除能力，单克隆抗体2D2的发挥效力时间稍迟于多抗对照组，但2D2的细菌清除能力明显高于空白和阴性对照两个组，说明单克隆抗体2D2具有较好的细菌清除能力。为了鉴定MAb 2D2对应的抗原表位，本实验利用制备的MAb 2D2为靶分子对噬菌体线性12肽库进行了生物筛洗,经过3轮的筛选,获得了针对靶分子的噬菌体克隆1000余倍的富集。从第3轮筛选的克隆中随机挑选12个进行ELISA,结果发现这12个克隆均具有与该单抗结合的活性，经过DNA测序分析发现这12个克隆具有相同的核心序列GAPMHMATL。通过BLASTp分析，这个核心序列与巴氏杆菌属的放线杆菌的FeoB蛋白的572-579位氨基酸有88%的相似性，并且根据western-blot结果发现该单抗所识别蛋白大小约为67Kd，也与FeoB蛋白大小相符。FeoB是Feo的组成之一。Feo蛋白是位于细胞质膜上的转运二价游离铁离子的转运蛋白。关于亚铁离子的转运蛋白Feo作为毒力蛋白的研究在单胞菌、细螺旋体、幽门螺杆菌、弗氏致贺菌、沙门氏菌、军团杆菌和蓝藻菌中均有报道。在本次试验中我们获得了一株在小鼠体内具有细菌清除能力的单克隆抗体，并且成功的运用了噬菌体展示技术鉴定了这株单克隆抗体的表位。该实验结果为进一步了解HPS的蛋白抗原结构和功能的关系，为研制副猪嗜血杆菌新型疫苗和及药物治疗提供了依据。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-13
第一章副猪嗜血杆菌的研究进展  13-19
  1.1 副猪嗜血杆菌研究概况  13-16
    1.1.1 病原学  13
    1.1.2 诊断和分型  13-14
    1.1.3 流行病学  14
    1.1.4 毒力相关因子的研究  14-15
    1.1.5 关于转铁蛋白的研究  15-16
  1.2 抗原表位研究  16-17
    1.2.1 B 细胞抗原表位的研究技术  16-17
  1.3 噬菌体展示技术  17-18
    1.3.1 噬菌体展示技术的原理  17
    1.3.2 噬菌体展示技术在抗原表位研究中的应用  17
    1.3.3 噬菌体展示技术的优势  17-18
  1.4 研究目的和意义  18-19
第二章副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验  19-25
  2.1 材料与方法  19-21
    2.1.1 病料来源  19
    2.1.2 培养基  19
    2.1.3 核酸提取  19
    2.1.4 PCR 鉴定  19
    2.1.5 细菌分离与鉴定  19-20
    2.1.6 tbpA 的扩增及产物纯化  20
    2.1.7 RFLP 分型  20
    2.1.8 生化鉴定  20
    2.1.9 药敏试验  20-21
  2.2 实验结果  21-23
    2.2.1 PCR 的鉴定结果  21
    2.2.2 tbpA 的PCR 扩增  21-22
    2.2.3 RFLP 分型  22
    2.2.4 生化鉴定结果  22-23
    2.2.5 药敏试验结果  23
  2.3 讨论  23-25
第三章单克隆抗体制备  25-33
  3.1 材料  25
    3.1.1 菌株与实验动物  25
    3.1.2 试剂与药品  25
    3.1.3 仪器与设备  25
  3.2 实验方法  25-26
    3.2.1 副猪嗜血杆菌培养  25
    3.2.2 动物免疫  25-26
    3.2.3 外膜蛋白提取  26
  3.3 单克隆抗体的制备  26-30
    3.3.1 饲养层细胞的制备  26
    3.3.2 SP2/0 细胞与脾细胞的制备  26-27
    3.3.3 细胞融合  27
    3.3.4 间接ELISA 法检测系统的建立  27
    3.3.5 阳性杂交瘤细胞的筛选  27-28
    3.3.6 阳性杂交瘤细胞的克隆  28
    3.3.7 阳性杂交瘤细胞冻存与复苏  28
    3.3.8 单克隆抗体腹水的制备及效价的测定  28
    3.3.9 腹水中单克隆抗体的纯化  28-29
    3.3.10 杂交瘤细胞的鉴定  29
    3.3.11 单克隆抗体亚类的鉴定  29
    3.3.12 单克隆抗体特异性的鉴定  29-30
  3.4 结果  30-31
    3.4.1 间接ELISA 方法的建立  30
    3.4.2 杂交瘤细胞株的建立  30
    3.4.3 杂交瘤细胞染色体分析  30
    3.4.4 单克隆抗体亚类的鉴定  30-31
    3.4.5 单克隆抗体纯化以及浓度测定  31
    3.4.6 单克隆抗体鉴定  31
  3.5 讨论  31-33
第四章细菌体内清除实验  33-38
  4.1 材料与方法  33
    4.1.1 菌株与实验动物  33
    4.1.2 主要试剂与药品  33
    4.1.3 仪器设备  33
  4.2 实验方法  33-34
    4.2.1 副猪嗜血杆菌培养  33
    4.2.2 副猪嗜血杆菌生长曲线的测定  33-34
    4.2.3 多克隆抗体血清的制备  34
    4.2.4 小鼠感染试验  34
    4.2.5 单克隆抗体体内细菌清除试验  34
  4.3 结果  34-36
    4.3.1 细菌生长曲线的测定  34-35
    4.3.2 动物感染实验  35
    4.3.3 体内杀菌试验  35-36
  4.4 讨论  36-38
第五章利用噬菌体展示技术鉴定抗原表位  38-43
  5.1 材料和方法  38-40
    5.1.1 材料  38
    5.1.2 主要仪器设备  38
    5.1.3 肽库的生物筛选  38
    5.1.4 噬菌体的滴度测定  38-39
    5.1.5 扩增噬菌体  39
    5.1.6 噬菌体ELISA  39
    5.1.7 测序模板制备及其序列测定  39
    5.1.8 短肽序列的推倒及表位分析  39-40
  5.2 结果  40-41
    5.2.1 淘选产率  40
    5.2.2 噬菌体ELISA 检测结果  40
    5.2.3 DNA 序列测定及表位分析  40-41
  5.3 讨论  41-43
第六章结论  43-44
参考文献  44-47
致谢  47-48
作者简历  48

副猪嗜血杆菌的分离与单抗制备及其抗原表位鉴定

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