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嗜水气单胞菌的分子流行病学调查及其两种分型方法的研究

作　者: 王春瑞
导　师: 金珊；沈锦玉
学　校: 宁波大学
专　业: 水产养殖
关键词: 嗜水气单胞菌流行病学双重PCR 血清分型 ERIC-PCR
分类号: S941.42
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)可引起水产动物传染性、爆发性疾病,在我国淡水养殖发达的华东地区,每年由此菌引起的淡水鱼类流行性疾病给该地区养殖业造成的经济损失尤为严重。为阐述华东地区主要淡水养殖鱼类嗜水气单胞菌病的分子流行病学特征,本研究采用传统流行病学调查与分子生物学技术相结合的方法进行了嗜水气单胞菌的分离鉴定、分型及其分子流行病学等方面的研究。主要研究工作包括如下几个部分:2009年4月~2009年11月,采用实地采样、调查等方法,跟踪调查了华东地区的11个淡水养殖场主要养殖鱼类嗜水气单胞菌病的发病及流行情况,并对所分离病原菌进行了致病性嗜水气单胞菌的双重PCR鉴定。结果表明:嗜水气单胞菌自4月至11月均有检出;相关疾病发病率达73%,发病范围广,7~9月为疾病高发期,发病后平均死亡率为20%~30%;对团头鲂、鲫鱼等危害最为严重。发病原因主要由于夏、秋季节持续高温使得嗜水气单胞菌大量滋生,加之鱼种放养密度过高,养殖水体环境恶化,养殖区域过度密集等,诱发了疾病的广泛流行。以O:5典型菌株BSK-10和O:9典型菌株TPS-30制备相应O抗原血清,并以此对分离、鉴定出的35株致病性嗜水气单胞菌进行血清分型。结果表明:O:5血清型菌株5株,O:9血清型菌株12株,非O:5或O:9菌株18株;O:5、O:9广泛分布于浙江、江苏、安徽等地,两种血清型菌株在鲢、鳙、鲫、鳊等宿主鱼类上均有分离,且以嗜水气单胞菌病高发的夏、秋季更为多见。采用ERIC-PCR技术对分离、鉴定的35株致病性嗜水气单胞菌进行指纹图谱分型分析,进一步从基因水平上描述我国华东地区鱼源嗜水气单胞菌的流行病学特征。结果表明:在聚类重新标定距离为10的水平下,可以把35株菌归为5个类群,而E1类群可能是当前我国华东地区鲤科鱼类病原性嗜水气单胞菌的优势基因型类群;菌株基因型的地域性差异明显;菌株基因型无明显宿主差异,说明鲫、鳊、鲢、鳙的嗜水气单胞菌相关疾病的病原菌是一致的;不同季节的流行性基因型类群菌株有所不同。与传统血清分型方法相比,ERIC-PCR耗时少,操作简便,图形重复性和分辨率好,能够据此对所有菌株进行基因水平差异与关联上的分析,可作为一种实用的手段应用于嗜水气单胞菌分子流行病学调查与监测。该研究对把握我国华东地区鱼源嗜水气单胞菌的流行病学特征有重要意义,可为制备针对性更强的疫苗提供科学依据,也为临床进行该病原菌的诊断与监测提供可靠方法。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 绪论  13-24
  1.1 嗜水气单胞菌的生物学特性及其流行病学特征  13-14
    1.1.1 细菌形态及其培养特性  13-14
    1.1.2 水产动物嗜水气单胞菌相关疾病的流行病学特征  14
  1.2 嗜水气单胞菌的主要毒力因子  14-15
    1.2.1 外毒素  14-15
    1.2.2 胞外蛋白酶（Extracellular protease）  15
    1.2.3 粘附因子  15
  1.3 嗜水气单胞菌的主要检测技术  15-17
    1.3.1 生化鉴定  15-16
    1.3.2 免疫学检测  16
    1.3.3 分子生物学检测  16-17
  1.4 嗜水气单胞菌的分型研究  17-19
    1.4.1 血清学分型  17-18
    1.4.2 基因分型  18-19
  1.5 嗜水气单胞菌的蛋白质组学研究  19-21
    1.5.1 采用蛋白质组学方法研究嗜水气单胞菌的生长代谢  19-20
    1.5.2 胁迫条件下嗜水气单胞菌的蛋白质组学研究  20
    1.5.3 嗜水气单胞菌二维电泳（2-DE）图谱的构建与分析  20-21
    1.5.4 蛋白质组学在嗜水气单胞菌耐药性机制研究中的应用  21
    1.5.5 嗜水气单胞菌的免疫蛋白质组学与亚蛋白质组学研究  21
  1.6 水产动物嗜水气单胞菌相关疾病的防治  21-23
  1.7 本研究的目的及意义  23-24
2 华东地区鱼源嗜水气单胞菌病的流行病学调查  24-35
  2.1 材料与方法  24-27
    2.1.1 主要仪器与试剂  24-25
    2.1.2 嗜水气单胞菌的分离与初步筛选  25-26
    2.1.3 双重PCR 鉴定致病性嗜水气单胞菌  26-27
    2.1.4 流行病学资料的获取及分析  27
  2.2 结果与分析  27-32
    2.2.1 致病性嗜水气单胞菌的双重PCR 鉴定结果  27-30
    2.2.2 华东地区淡水鱼类嗜水气单胞菌病的流行病学分析  30-31
    2.2.3 嗜水气单胞菌病流行的主要因素  31-32
  2.3 讨论  32-35
3 致病性嗜水气单胞菌的血清学分型  35-44
  3.1 材料与方法  36-40
    3.1.1 主要仪器及试剂  36
    3.1.2 相关试剂的配制  36-37
    3.1.3 实验动物及菌株来源  37-38
    3.1.4 嗜水气单胞菌O:5、O:9 多克隆抗体血清的制备  38-40
    3.1.5 玻片凝集法鉴定血清型  40
  3.2 结果与分析  40-42
    3.2.1 血清分型结果  40-41
    3.2.2 血清流行病学特征  41-42
  3.3 讨论  42-44
4 致病性嗜水气单胞菌的ERIC-PCR 指纹图谱分型  44-51
  4.1 材料与方法  45-46
    4.1.1 主要仪器与试剂  45
    4.1.2 实验菌株  45
    4.1.3 DNA 模板制备及浓度测定  45-46
    4.1.4 ERIC-PCR 引物设计  46
    4.1.5 ERIC-PCR 反应  46
    4.1.6 ERIC-PCR 扩增重复性试验  46
    4.1.7 聚类分析  46
  4.2 结果与分析  46-49
    4.2.1 ERIC-PCR 指纹图谱  46-47
    4.2.2 致病性菌株扩增结果的聚类分析  47-49
  4.3 讨论  49-51
5 结论与展望  51-56
  5.1 主要结论  51-53
    5.1.1 嗜水气单胞菌病的流行病学特征  51-52
    5.1.2 致病性嗜水气单胞菌的血清型鉴定  52
    5.1.3 致病性嗜水气单胞菌的ERIC-PCR 指纹图谱分型  52-53
    5.1.4 两种分型方法的优劣  53
  5.2 研究展望  53-56
    5.2.1 深入展开嗜水气单胞菌的致病、抗药机理研究  53
    5.2.2 建立健全嗜水气单胞菌相关疾病的综合防治模型  53-54
    5.2.3 加强嗜水气单胞菌病的免疫防御研究  54
    5.2.4 研究探索高效安全的生物防治途径  54
    5.2.5 建立完善的水产动物健康养殖模式  54-56
参考文献  56-64
附录A 主要名词缩略表  64-66
在学研究成果  66-67
致谢  67-68

嗜水气单胞菌的分子流行病学调查及其两种分型方法的研究

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