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ω-CTX MVIIA抗体制备的研究

作　者: 李恒
导　师: 汪世华
学　校: 福建农林大学
专　业: 微生物学
关键词: 芋螺毒素单链抗体 RT-PCR 噬菌体展示 ELISA
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

芋螺毒素(Conotoxin,CTX)是从热带海洋肉食性软体动物芋螺(Conus)中得到的一类具有生物学活性的小分子肽类毒素,是芋螺进行捕食的主要工具。ω-芋螺毒素(ω-CTX)是电压敏感型钙离子通道(voltage sensitive calcium channel,VSCC)特异性阻断剂,中毒者往往出现肢体麻木、瘫痪等症状,严重的可导致死亡。目前还没有简单有效的检测方法。本研究获得了抗芋螺毒素的基因工程单链抗体,建立了一种基于基因工程单链抗体的检测芋螺毒素的方法,以便最终快速有效地检测海产品中芋螺毒素的含量。ω-芋螺毒素为小分子肽类毒素,仅由24-29个氨基酸组成,为半抗原。若直接以其进行动物免疫,无法产生免疫效果。成功构建了芋螺毒素与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的重组蛋白,作为小鼠免疫用抗原;同时还构建了芋螺毒素与硫氧还蛋白(TRX)的重组蛋白,作为检测用抗原。重组蛋白经过表达纯化后检测蛋白浓度,GST-CTX的浓度为0.42 mg/mL,TRX-CTX的浓度为0.24 mg/mL。经过四次免疫后,测小鼠血清中抗芋螺毒素抗体的效价。血清效价最终达到了32000,处死后提取脾脏总RNA。通过RT-PCR获得cDNA第一链。以此链为模板,经PCR得到抗体重链可变区和轻链可变区基因(VH,VL),以编码(Gly4Ser)3的核苷酸序列作为linker,通过交错延伸PCR将VH和VL基因组装为完整的scFv基因。条带位置在750 bp左右。将scFv基因克隆入噬菌体载体pCANTAB-5E中,构建了噬菌体单链抗体库。经过计算初始的文库大约为4.8×106 cfu/mL。经过七轮的富集淘选,最终从噬菌体抗体库中筛选到一株亲和力较高的单链抗体。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-24
  引言  11
  1 芋螺毒素研究概况  11-16
    1.1 芋螺毒素的分布及危害  11-12
    1.2 芋螺毒素的结构及分类  12-13
    1.3 芋螺毒素的作用机理  13-16
      1.3.1 作用于电压门控离子通道的芋螺毒素  13-15
      1.3.2 作用于配体门控离子通道的芋螺毒素  15-16
      1.3.3 作用于其他受体的芋螺毒素  16
  2 芋螺毒素的检测  16-17
    2.1 高效液相色谱法  16
    2.2 电喷雾-四极杆-飞行时间质谱  16-17
    2.3 铜螯合纳米磁珠结合生物质谱  17
    2.4 免疫学检测方法  17
  3 噬菌体展示技术  17-24
    3.1 噬菌体展示技术概述  17-18
    3.2 噬菌体展示技术在抗体方向的应用  18-22
      3.2.1 抗体的结构  18-20
      3.2.2 基因工程抗体  20-22
    3.3 噬菌体抗体库  22-24
第二章 ω-CTX MVIIA 的高效表达  24-39
  引言  24-25
  材料与方法  25-32
    1 材料  25-26
      1.1 菌株与质粒  25
      1.2 培养基  25
      1.3 试剂与材料  25-26
    2 实验方法  26-32
      2.1 大肠杆菌质粒的提取  26
      2.2 ω-CTX MVIIA 蛋白质序列及基因序列的获得  26-27
      2.3 ω-CTX MVIIA 基因寡核苷酸链的处理  27
      2.4 重组质粒pGEX-6p-1-ctx 的构建  27
      2.5 重组质粒pET32a(+)-ctx 的构建  27-28
      2.6 大肠杆菌的转化  28
        2.6.1 感受态细胞的制备  28
        2.6.2 大肠杆菌的转化  28
      2.7 重组质粒的筛选、检测  28
      2.8 GST-CTX 蛋白质的诱导表达  28-29
      2.9 GST-CTX 融合蛋白的纯化  29
      2.10 TRX-CTX 蛋白的诱导表达及纯化  29-30
      2.11 透析及浓缩  30
      2.12 SDS-PAGE 分析蛋白纯度及分子量  30
      2.13 蛋白质的浓度测定  30-32
  结果与分析  32-36
    1 重组质粒pGEX-6p-1-ctx 及pET32a(+)-ctx 的构建  32-33
    2 融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化  33-34
    3 蛋白浓度的测定  34-36
  讨论  36-38
    1 ω-CTX MVIIA 蛋白质序列及基因序列的获得  36
    2 ω-CTX MVIIA 的原核表达载体的构建  36
    3 融合蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化  36-37
    4 蛋白质浓度的测定  37-38
  结论  38-39
第三章单链抗体的淘选  39-61
  引言  39-40
  材料与方法  40-49
    1 材料  40-41
      1.1 细胞及细胞株  40
      1.2 质粒载体  40
      1.3 PCR 引物  40-41
      1.4 试剂与材料  41
      1.5 培养基  41
    2 实验方法  41-49
      2.1 动物免疫  41-42
      2.2 测血清效价  42
      2.3 总RNA 的提取  42-43
      2.4 第一链cDNA 反转录合成  43
      2.5 轻、重链基因的扩增  43-44
      2.6 scFv DNA 的组装与扩增  44
      2.7 scFv DNA 片段的SfiⅠ和NotⅠ酶切  44-45
      2.8 pCANTAB 5E-scFv 重组质粒的构建  45-46
      2.9 重组噬菌体的制备  46
      2.10 库容量的滴定  46-47
      2.12 用ELISA 方法检测CTX 蛋白质特异性的单链抗体  47
      2.13 scFv 序列分析  47
      2.14 scFv 单链抗体可溶性表达与ELISA 检测  47-49
  结果与分析  49-58
    1 效价的测定  49-50
    2 脾脏总RNA 提取及cDNA 合成  50-51
    3 V_H 和V_L 的扩增  51-52
    4 scFv 基因的组装与扩增  52-53
    5 噬菌体重组质粒载体的构建  53
    6 噬菌体抗体库的构建  53
    7 噬菌体抗体库富集淘选scFv  53-54
    8 单链抗体特异性鉴定  54-55
    9 单链抗体的PCR 和酶切验证  55-56
    10 scFv 的可溶性表达与ELISA 检测  56-58
  讨论  58-60
    1 小鼠免疫与血清效价测定  58
    2 总RNA 提取  58-59
    3 单链抗体的制备过程  59-60
    4 抗体基因的酶切  60
  结论  60-61
参考文献  61-65
致谢  65-66
附录  66-76

ω-CTX MVIIA抗体制备的研究

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