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目的:精索静脉曲张是青壮年男性中的常见病及多发病,是由于精索静脉血液回流受阻或静脉瓣膜功能失效而导致精索静脉迂曲扩张所致。精索静脉曲张好发于左侧,是由于左侧精索静脉是以直角注入左肾静脉,而右侧精索静脉是以斜角注入下腔静脉等解剖结构原因造成的。WHO将精索静脉曲张列为青壮年男性不育原因的第一位,可见精索静脉曲张在男性不育中的重要地位。目前研究表明精索静脉曲张致男性不育涉及到免疫、内分泌、细胞凋亡、血液反流、温度变化及感染等多方面原因,但均不能完全解释其发病机制。本研究通过实验性精索静脉曲张动物模型的建立,在透射电镜下观察睾丸生精细胞、间质细胞、支持细胞的超微结构,利用计算机辅助精液分析(CASA)系统研究精子运动能力及形态,来揭示精索静脉曲张导致男性不育的机理,为临床精索静脉曲张的研究和治疗提供参考。方法:1动物分组:选择鼠龄(50±10)天(青春期),体重240～280g的SD(Sprayue-Dawley)三级雄性大鼠40只,将大鼠随机分为精索静脉曲张组(实验组)20只,假手术组(对照组)20只,所有大鼠在同等条件下饲养12周,自由饮食、饮水。2模型的建立:精索静脉曲张动物模型按Turner法建立,用10%水合氯醛(3.33 ml/kg)腹腔注射麻醉,固定后取上腹正中切口,打开腹腔后,将左肾周围的内脏组织移到右侧,使左侧肾脏及左肾静脉完全暴露,在左肾至下腔静脉间完全分离出左肾静脉,于左肾上腺静脉与下腔静脉之间置一8号注射器的针头(直径约0.8mm),在左肾静脉与下腔静脉交叉处用3-0的丝线将针头与左肾静脉一同结扎,这样大约就能使左肾静脉直径缩小一半,然后抽出针头,可见到左肾静脉扩张充血,用生理盐水冲洗腹腔后4-0的丝线依次缝合切口;假手术组完全显露出左肾静脉后只穿线打结,而不缩窄左肾静脉,余步骤同手术组。术后连续三天腹腔注射青霉素(20万单位1/日),术后第12周将两组大鼠分别脱颈处死,如果手术组左侧精索静脉直径大于1mm,并且左右两侧肾脏重量无明显差别表示动物模型建立成功。3睾丸电镜标本的采集及观察:手术摘取两组动物左侧睾丸后,立即切取约1mm3大小睾丸组织放入含2%戊二醛和1%多聚甲醛混合液中,在混合液中固定24小时后,立即用pH值为7.4的PBS液漂洗12小时,然后将标本放入1%四氧化锇酸液中再固定2小时,再次用pH值为7.4的PBS液漂洗,随后用梯度乙醇将标本脱水,再用环氧树脂将其包埋,制作成超薄切片,经醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色后,以HITACHI-H7500型透射电镜观察睾丸的超微结构。4精液标本的采集及检测:脱颈处死大鼠后,立即摘取两组动物的附睾,并剔除掉附睾周围的脂肪组织,用PBS液洗净后,切下附睾的尾部,然后用眼科剪在其尾部切开三个纵行的裂口,立即放入2ml的离心管中,将PBS液加至2ml,然后将离心管放入37℃水浴箱中,让精子自由游出,水浴20分钟后将离心管取出。4.1用微量移液器吸取10μl上层的精液悬液,采用计算机辅助精液分析(CASA)系统进行精子运动能力的检测。观察参数为:精子密度(ρ),精子活率(MOT),直线运动精子密度,直线运动精子活率,路径速度(VAP), a级快速向前运动,b级快速向前运动,曲线速度(VCL),直线速度(VSL),鞭打频率(BCF),平均移动角度(MAD),线性度(LIN),前向性(STR),摆动性(WOB),侧摆幅值(ALH)。4.2用可调节加样器吸取40μl精子悬液滴在载玻片上,然后用加样吸头侧向轻轻将悬液推开,让其自然晾干,用甲醇固定10min后,再自然晾干,然后将载玻片放入含有1%伊红染液的染色缸中染色,染色1.5小时后将载玻片取出并用自来水冲洗,自然晾干(每个精液标本制片2张),最后,在光学显微镜下观察精子的形态,计算精子畸形率。所有数据用( X±s)表示,两组间差异比较采用Wilcoxon符号秩检验。用SPSS13.0软件包进行统计分析,检验水准为a=0.05或a=0.01。结果:1电镜观察的结果:实验组与对照组相比较,支持细胞基膜水肿,细胞间大部分融合,Sertoli-Sertoli细胞连接模糊不清或者断裂,胞质内线粒体及滑面内质网的数量明显减少,可见大量的溶酶体颗粒;间质细胞表面的微绒毛,胞质内的线粒体及滑面内质网数量均明显较少,胞质内可见大量的溶酶体颗粒,较大的空泡,凋亡细胞增加,染色质固缩;精子细胞核畸形,核内可见大量的空泡、核膜消失,顶体消失或为小顶体,染色质过度浓缩。2精液分析的结果:实验组与对照组相比较,精子活率(MOT)、前向性(STR)的值降低,两组之间存在显著性差异(P<0.05);精子密度(ρ)、直线运动精子密度、直线运动精子活率、路径速度(VAP)、a级快速前向运动、b级快速前向运动、曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、侧摆幅度(ALH)值明显降低,而畸形率显著增加,两组之间比较具有显著性(P<0.01);精子平均移动角度(MAD)、线性度(LIN)、摆动性(WPB)、鞭打频率(BCF)的值无明显变化,两组之间比较无差异性(P>0.05)。结论:1精索静脉曲张可导致睾丸支持细胞线粒体、滑面内质网数量减少,溶酶体数量增加,细胞间的紧密连结破坏。2精索静脉曲张可导致睾丸间质细胞线粒体、滑面内质网数量减少,溶酶体、凋亡细胞数量增加,染色质固缩。3精索静脉曲张可导致睾丸精子细胞核畸形,核膜、顶体消失,染色质固缩。4精索静脉曲张可导致精子运动能力降低,精子畸形率增加,从而使生育能力降低。
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