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内毒素对人牙周膜细胞表达TLR2和TLR4的影响

作　者: 段立立
导　师: 许丽华
学　校: 河北医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 内毒素 牙周炎 牙周膜细胞 TLR2 TLR4
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:Toll样受体（Toll- like receptors, TLRs）是天然免疫受体家族中的一员,主要存在于免疫细胞的表面。TLRs属于Ⅰ型跨膜受体及病原体的模式识别受体是白细胞介素-1受体超家族成员,可以识别病原体所特有的保守结构,这种保守结构被称为病原相关分子模式（Pathogen association molecular pattern, PAMP）,例如内毒素（lipopolysaccharide, LPS）。宿主的炎症反应起始于TLRs对病原相关分子模式的识别,引起细胞内信号传导,从而引起细胞因子分泌,启动炎症反应。越来越多的研究证实,TLR2和TLR4与牙周疾病的发生、发展密切相关,有着重要的临床意义。口腔内存在大量的细菌,牙周病是以革兰氏阴性厌氧菌为主的混合感染,内毒素是革兰氏阴性菌死亡破裂后由细胞壁外膜释放出的具有特殊结构的物质,是牙周致病菌的主要毒力因子,可穿过上皮进入深部的结缔组织。牙周膜细胞（Periodontal ligament cells, PDLCs）是牙周膜内的主要组织细胞,具有较强合成胶原的能力,对牙周组织健康的维持以及牙齿的稳固十分重要。牙周膜细胞是否可以作为免疫细胞参与局部牙周免疫反应成为学者们关注的热点。本实验旨在探讨体外培养的人牙周膜细胞是否表达Toll样受体2和4,以及观察在不同的时间段内毒素刺激对牙周膜细胞表达TLR2和TLR4有何影响,以了解Toll样受体在牙周病中的免疫学作用。方法:1于临床上取得12-26岁患者因正畸拔除的双尖牙,无菌湿润条件下刮取根中三分之一的牙周膜组织,采用传统组织块法进行人牙周膜细胞的原代培养,运用第三代细胞进行免疫组织化学染色,通过波形蛋白和角蛋白染色鉴定细胞来源。2选用第四代生长良好的处于对数生长期的牙周膜细胞,制成4×104/ml的单细胞悬液接种于96孔板内,每孔体积200 ul,共铺7板,每板复种三孔,并设未加细胞的孔调零,运用四唑盐比色法（Methlthazoletrazolium, MTT）绘制牙周膜细胞的生长曲线。3、选用第四代生长良好的牙周膜细胞,以5×104∕ml的密度传代到底部放有圆形盖玻片的24孔培养板内,加入适量的高糖DMEM培养液,放入CO2培养箱中培养,使培养板中的细胞均匀的贴壁生长并基本铺满盖玻片。弃原培养液,实验组用含10μg/ml内素素的DMEM培养液分别培养4、8、12和24 h,阴性对照组不加内毒素仅用DMEM培养,收集各组的细胞爬片,丙酮固定,运用免疫细胞化学染色法检测TLR2和TLR4在牙周膜细胞中的表达的量,从而观察内毒素刺激牙周膜细胞后对TLR2和TLR4表达的影响。利用多功能真彩色细胞图像分析管理系统对染色标本进行图像分析,每张爬片随机选择5个高倍视野（×400）,根据Soslow RA的评分方法进行免疫组化评分（Immunohistochemical score, IHS）,分别计算TLR2和TLR4在各组的得分并进行统计学处理。结果:1成功培养人牙周膜细胞,原代培养的牙周膜细胞以组织块为中心呈放射状排列,倒置显微镜下见培养的细胞呈星形或长梭形,有两个到四个细胞突,胞体丰满,胞浆均匀,核圆形或卵圆形,核仁清晰,数量1-3个不等。免疫细胞化学染色结果显示:体外培养的人牙周膜细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性,阳性部位位于胞浆;抗角蛋白染色阴性。证实细胞来源于中胚层,符合成纤维细胞的生物学特性。2第四代牙周膜细胞运用MTT法绘制生长曲线结果显示:牙周膜细胞生长曲线成典型的“S”形,经历了潜伏期、对数生长期和平台期三个生长阶段。3免疫细胞化学染色方法检测牙周膜细胞在内毒素刺激下不同时间段TLR2和TLR4表达情况的结果显示:健康的牙周膜细胞少量表达TLR2和TLR4,经内毒素刺激后TLR2和TLR4表达的量明显增加,各个实验组染色强度均显著高于阴性对照组（P<0.05）,且随内毒素刺激时间的延长而染色增强,在内毒素刺激24 h后的表达达到峰值。免疫组化染色显示相同时间段下各个实验组的TLR2的表达均显著高于TLR4的表达（P <0.05）。结论:1成功培养人牙周膜细胞。2正常人牙周膜细胞可少量表达TLR2和TLR4,LPS的刺激可上调TLR2与TLR4的表达,相同的检测时间段TLR2比TLR4表达较强。提示牙周膜细胞参与牙周局部免疫反应。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-12
材料与方法  12-16
结果  16-18
附图  18-27
附表  27-28
讨论  28-33
结论  33-34
参考文献  34-37
综述 内毒素受体TLR2和TLR4与牙周炎关系的研究进展  37-47
  参考文献  43-47
致谢  47-48
个人简历  48

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中图分类: > 医药、卫生 > 口腔科学 > 口腔内科学 > 牙周病
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