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富血小板血浆对小型猪牙周膜细胞增殖和分化的影响

作　者: 赵斌
导　师: 林崇韬
学　校: 吉林大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 牙周膜细胞小型猪富血小板血浆牙周组织再生
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

牙周炎是口腔微生物感染、以牙周支持组织进行性破坏为主要特征的慢性疾病。大量研究证实,牙周炎与全身健康和系统性疾病有着双向的密切联系。牙周炎表现为牙周膜、牙槽骨、牙骨质及牙龈组织结构及完整性改变,引起结缔组织基质和细胞的破坏,导致牙周袋的形成、牙槽骨的吸收和附着丧失,直至牙齿松动、移位、脱落。修复缺损的牙周软硬组织是临床治疗中急需解决的难题,也是基础研究一直探讨的热点。近年来,细胞、生长因子和支架材料构成的组织工程学的迅猛发展为牙周组织的再生修复带来了契机。寻求有效的促牙周组织再生修复的生长因子,增强牙周再生相关细胞的生物学功能,成为行之有效的促组织修复的手段之一。牙周组织创伤愈合的相关的细胞有牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞。在这之中,只有牙周膜细胞具有干细胞的特性,有较强的增殖和多向分化的潜能。通过其自身不断增殖和分化,不仅可形成新的牙周膜纤维,还可参与牙槽骨、牙骨质的改建,是牙周组织修复再生最为理想的种子细胞。小型猪的口腔解剖、牙颌系统、生理病理和营养代谢等与人类有着极大的相似性,其体态矮小,口颌较小,操作容易等特点已逐步应用于医学研究的各个领域。更为重要的是,小型猪与人类有着相近的龈下菌群,可自发性形成牙周炎,是理想的牙周炎实验动物模型。已有报道,小型猪PDLCs具有成纤维细胞的形态,表达Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和碱性磷酸酶等,具有分化潜能,与体外分离培养的人牙周膜细胞的特性一致。因此,选择小型猪作为牙周炎实验对象,应用于临床前研究,展现出良好的应用前景。富血小板血浆是全血经离心后,得到的血小板浓缩物。研究表明,PRP经凝血酶和Cacl2激活后,PRP中血小板的α颗粒便释放出多种、高浓度的生长因子和细胞因子,包括:血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likegowth factor,IGF)、转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)、血管内皮生长因子(Vaseular endothelial growth factor,VEGF)、骨钙素和纤维结合蛋白等,修复受损的组织,促进组织愈合。PRP的优越性在于:来源于自体,完全天然和安全;含有生长因子的种类多、浓度高,避免单一应用生长因子的缺点;制作简单、技术成熟,对机体无创伤,引起了国内外学者研究的兴趣。目前PRP在牙周修复方面的研究多集中在体内实验,而PRP对牙周膜细胞的生物学特性的研究较少。PRP促牙周膜细胞增殖和分化的有效浓度和作用时间报道不一,且PRP和细胞并非来源于一体。基于以上研究背景,本实验选择小型猪为实验对象,探讨不同浓度PRP在不同时间点对自身PDLCs的生物学作用,为牙周组织修复再生提供一定的理论依据,为进一步实验研究奠定基础。方法:拔除6月龄的小型猪上下颌4颗切牙和4颗尖牙,刮取跟中1/3牙周膜,采用组织块培养法原代培养小型猪PDLCs;细胞鉴定、绘制生长曲线及确定细胞最佳铺板浓度确定。二步离心法制作小型猪自体PRP,激活后,收集富生长因子浓缩液(preparation rich in growth factors,PRGF)。分别用2.5%、5%、10%、20%和40%的富生长因子液作用于小型猪PDLCs,MTT法检测1～6d细胞增殖情况,考马斯亮蓝和碱性磷酸酶试剂盒检测3d、5d和7d细胞分化的水平,以PBS对照。结果:小型猪PDLCs的培养成功率为50%,切牙的成功率为100%;小型猪PDLCs生长曲线呈S型;5×10~3/孔为最佳细胞铺板浓度。各浓度PRP促细胞增殖和ALP活性的作用于对照组相比有统计学意义或显著差异( P<0.05,P<0.01);PRP浓度从2.5%增至10%时,细胞增殖和ALP活性随浓度和时间增加;PRP浓度达到20%时,抑制细胞增殖而促分化;PRP浓度达到40%时,显示对细胞增殖和分化有明显抑制作用。结论:在1d～7d内,低浓度的PRP对小型猪PDLCs的体外增殖和ALP活性均有促进作用,高浓度则有抑制作用,一定范围内呈剂量依赖关系。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
英文缩写词表  11-12
第1章前言  12-14
第2章材料和方法  14-15
  2.1 主要仪器  14
  2.2 主要试剂  14-15
第3章论文主体  15-26
  3.1 小型猪牙周膜细胞的培养  15-17
    3.1.1 实验动物及组织来源  15
    3.1.2 小型猪PDLCs 原代培养  15-16
    3.1.3 小型猪PDLCs 传代培养  16
    3.1.4 小型猪PDLCs 冻存  16
    3.1.5 小型猪PDLCs 复苏  16-17
  3.2 小型猪PDLCS 的鉴定  17-18
    3.2.1 制备细胞爬片  17
    3.2.2 SP 法抗波形丝蛋白、角蛋白染色  17-18
  3.3 绘制小型猪PDLCS 的生长曲线  18
  3.4 确定小型猪PDLCS 最佳铺板浓度  18
  3.5 富生长因子浓缩液的制备  18-19
    3.5.1 富血小板血浆的制备  18-19
    3.5.2 血小板计数  19
    3.5.3 富生长因子浓缩液的制备  19
  3.6 PRGF 对小型猪PDLCS 增殖的影响  19-20
  3.7 PRGF 对小型猪PDLCS 碱性磷酸酶活性的影响  20
    3.7.1 PRGF 对小型猪PDLCs 蛋白含量的测定  20
    3.7.2 PRGF 对小型猪PDLCs 的ALP 活性的影响  20
  3.8 统计学分析  20
  3.9 结果  20-26
    3.9.1 小型猪PDLCs 原代培养  20-21
    3.9.2 小型猪PDLCs 鉴定结果  21
    3.9.3 小型猪PDLCs 培养成功率  21-22
    3.9.4 小型猪PDLCs 的生长曲线  22
    3.9.5 小型猪PDLCs 的最佳铺板浓度  22-23
    3.9.6 血小板计数  23
    3.9.7 PRGF 对小型猪PDLCs 增殖的影响  23-24
    3.9.8 PRGF 对小型猪PDLCs 蛋白含量的影响  24-25
    3.9.9 PRGF 对小型猪PDLCs 的ALP 活性的影响  25-26
第4章讨论  26-34
  4.1 PDLCS 概论  26-27
  4.2 小型猪PDLCS 的特性  27-28
  4.3 小型猪PDLCS 的培养方法  28-29
  4.4 PRP 的生物学特性  29-30
  4.5 PRP 制备  30-31
  4.6 PRP 对小型猪PDLCS 的生物学作用  31-34
第5章结论  34-35
参考文献  35-40
综述  40-46
  参考文献  43-46
附录  46-48
导师及作者简介  48-49
致谢  49

富血小板血浆对小型猪牙周膜细胞增殖和分化的影响

内容摘要

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