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普通裂褶菌形态学观察及小鼠体内药物敏感性实验研究

作　者: 张金芳
导　师: 万力；高顺强
学　校: 河北医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 普通裂褶菌形态学动物实验药敏实验研究
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:普通裂褶菌﹙Schizophyllum commune﹚属真菌门,担子菌纲,伞菌目,裂褶菌科,裂褶菌属,广泛分布于自然界,多在春至秋季节生长,属于木腐生菌,野生于阔叶树及针叶树的枯枝倒木上,有的也发生在枯死的禾本科植物、竹类或野草上。在对人类致病方面,临床以吸入其孢子引起过敏反应比较常见,近年来临床上由普通裂褶菌感染引起人类和犬齿动物-狗深部组织真菌病的病例报道日渐增多,自1950年Kligman首次报道普通裂褶菌感染人类引起甲真菌病,60年来有关该菌感染引起体表或深部组织真菌病的病例报道近50例。普通裂褶菌作为一种潜在的条件致病菌日益受到临床及实验室的重视。本研究所用菌株分离自1例心脏搭桥术后患变应性支气管肺真菌病(ABPM)的患者的痰液,经中国科学院微生物研究所鉴定为Schizophyllum commune。本研究一方面通过对普通裂褶菌形态学观察,为临床上诊断普通裂褶菌感染提供实验室依据;另一方面,采用动物实验的方法,建立系统性普通裂褶菌感染小鼠模型,应用氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬三种常用抗真菌药物治疗系统性普通裂褶菌感染小鼠,通过对实验小鼠中位生存时间和生存率以及小鼠内脏(心、肝、脾、肺、肾)组织的真菌逆培养阳性率和肝脏组织载菌量的检测来评价它们在小鼠体内抗普通裂褶菌活性,为临床上治疗系统性普通裂褶菌感染提供依据。方法:1形态学观察1.1菌落大体形态学观察将我科保存菌株常温复苏3天,接种于含氯霉素的沙堡氏琼脂培养基﹙SDA﹚上,置于27℃和37℃恒温箱交替光照环境下培养4周,观察菌落生长情况。1.2小培养﹙方块法﹚将普通裂褶菌点种于含氯霉素的沙堡氏琼脂培养基﹙SDA﹚的小培养上,27℃和37℃恒温箱培养2周,观察菌丝生长情况。1.3光镜观察取其菌丝标本置于载玻片上,10%KOH溶液溶解后,盖上盖玻片,光镜下观察菌丝形态。2小鼠体内药敏试验2.1系统性普通裂褶菌感染动物模型的制作将我科保存菌株复苏,转种于SDA培养基上37℃培养7天。用无菌生理盐水制备成菌悬液,接种于小鼠体内使其感染,解剖小鼠分离出恢复毒力的菌株。分离出的菌株用无菌生理盐水制成菌悬液,通过腹腔注射途径接种于应用环磷酰胺免疫抑制的小鼠。2.2给药方法接种后第二天开始给药,氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬的给药剂量分别为:52mg/Kg、26mg/Kg和32.5mg/Kg,腹腔注射,1天1次,连续5天。2.3生存观察连续观察各组小鼠感染该菌后21天内的自然死亡情况,记录死亡日期和死亡只数。2.4组织真菌逆培养无菌条件下将各脏器用组织研磨器研碎后挑取少许分别接种于含氯霉素的沙堡氏琼脂平皿培养基中,37℃恒温箱培养,统计各组小鼠内脏逆培养阳性数。培养阳性的菌落分别移种至平皿培养基及小培养的培养基上培养,观察其菌落形态以及菌丝的形态。2.5肝脏真菌载菌量测定无菌条件下取各组死亡小鼠的肝脏,匀浆后进行组织的真菌平皿培养,计算肝脏的真菌载菌量。结果:1大体菌落观察沙堡氏琼脂培养基﹙SDA﹚上37℃培养2-3天菌落开始生长,1周后菌落直径约7cm,菌落中央形成同心状环纹区,菌丝白色,棉毛至羊毛状,浓密厚重,堆积高出于培养基表面,菌落表面出现微黄色液滴渗出物,培养基背面初为白色,其后变为淡黄色。释放出一种类似沼气的难闻的气味,在光照与黑暗交替的环境下,27℃和37℃恒温箱培养4周未见担子果形成。2光镜下观察可见发达的分支分隔菌丝,菌丝直径差别较大,在分隔处可见闭锁联合。在菌丝表面上常常发现侧生钉状突起,未见担子及担孢子形成。3小鼠感染后生存状况小鼠接种菌悬液后,进食明显减少,并逐渐消瘦,活动减少,精神差,给予药物治疗后,氟康唑组和伊曲康唑组小鼠进食增加,精神状况改善,而生理盐水对照组和特比萘芬组小鼠未见明显变化。4感染后死亡情况接种后第3天开始出现自然死亡,生理盐水对照组第6天达死亡高峰,第15天止,死亡22只;氟康唑组第7天达死亡高峰,第11天止,死亡9只;伊曲康唑组第7天达死亡高峰,第10天止,死亡8只;特比萘芬组第6-7天为死亡高峰,第14天小鼠不再死亡,死亡20只,与生理盐水对照组相比,21天观察期内生存率和中位生存天数有着显著性差异(P<0.05)。5脏器的大体改变各组实验小鼠内脏均有不同程度的病理变化,部分小鼠脏器表面可见白色化脓性病灶,以肝脏多见。6脏器组织病理HE染色可见大量炎细胞浸润形成的化脓性肉芽肿病变,PAS染色除肾脏外,均可在组织中看到紫红色的分支菌丝。7组织真菌逆培养部分小鼠内脏组织培养3天后可见白色菌落生长,其菌落形态及镜下结构与实验菌株一致。肝、脾逆培养阳性率:氟康唑组和伊曲康唑组较生理盐水对照组和特比萘芬组低,有显著性差异,氟康唑组和伊曲康唑组、生理盐水对照组和特比萘芬组之间无显著性差异。肺脏逆培养阳性率:氟康唑组与生理盐水对照组和特比萘芬组之间差异有统计学意义;各组小鼠心、肾逆培养阳性率较低,无显著性差异。8肝脏组织载菌量氟康唑组、伊曲康唑组、特比萘芬组肝脏组织载菌量较生理盐水对照组明显减少,氟康唑组与伊曲康唑组、特比萘芬组与生理盐水对照组之间肝脏组织载菌量无显著变化,氟康唑组与特比萘芬组、伊曲康唑组与特比萘芬组之间肝脏组织载菌有显著差异。结论:1氟康唑和伊曲康唑在小鼠体内均有较好的抗普通裂褶菌活性,显著提高了肝、脾组织的真菌清除率,降低了肝脏组织载菌量,延长了小鼠生存时间,提高了小鼠的生存率,而特比萘芬效果较差。2氟康唑和伊曲康唑在对小鼠生存率、生存时间、组织真菌清除率、肝脏组织载菌量方面的影响无显著性差异。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-12
材料与方法  12-16
结果  16-19
附图  19-31
附表  31-32
讨论  32-34
结论  34-35
参考文献  35-37
综述普通裂褶菌感染的临床及实验室研究现状  37-55
  参考文献  50-55
致谢  55-56
个人简历  56

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