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Th1和Th2型细胞因子在不同MHC-B单倍型鸡群中的表达分析

作　者: 蔡文博
导　师: 韩凌霞
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病 MHC 细胞因子双重荧光定量RT-PCR
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatablity complex, MHC)是鸡的免疫遗传相关基因,与疾病抗性或易感性有关,且与经呼吸系统感染的鸡恶性淋巴组织增生性疾病马立克氏病(Marek’s disease, MD)尤为密切。MD抗性鸡和易感鸡感染MDV(Marek’s disease virus, MDV)后,细胞因子的转录水平有所不同。为研究细胞因子的基础转录水平,本试验以5种MHC-B单倍型无特定病原体(SPF)鸡群G1、G2、G3、G5和G7为试验对象,利用双重荧光定量RT-PCR(dqRT-PCR)技术对肺组织(气管)、胸腺、法氏囊、脾脏和外周血淋巴细胞(PBL)中Th1型(IFN-γ、IL-18)和Th2型(IL-4、IL-10)细胞因子的mRNA含量进行了定量检测。结果显示,各组织中IL-18的转录水平最高,IL-4最低,IL-10和IFN-γ介于其间。70日龄时,IFN-γ和IL-4在各鸡群的胸腺中转录水平最高,IL-18和IL-10在法氏囊中最高,Th2型细胞因子在脾脏中最低。同时,初级免疫器官(胸腺、法氏囊)中IFN-γ和IL-10转录水平在MD抗性鸡群(G3系)中最高;肺组织、胸腺和脾脏中IL-18以及肺组织和法氏囊中的IL-4在MD易感鸡群(G7系)中最高,肺组织和PBL中IFN-γ在易感鸡中最低。不同组织中IL-4受日龄的调节不同,脾脏和PBL中IL-4在孵化后早期聚集较多,胸腺中70 d高于35 d,而肺脏在35 d时较高。PBL中IL-18在56 d达到高峰。不同单倍型鸡群法氏囊中细胞因子受日龄的调节不同。70 d时G2鸡群法氏囊中IFN-γ、IL-18和IL-10 mRNA含量高于35 d,而G5鸡群无明显变化(IL-18),甚至所下降(IFN-γ、IL-10)。随日龄增长(14 d~35 d),脾脏中IFN-γ转录水平升高,PBL中IL-18和IL-10下降。以上结果表明,不同功能的细胞因子转录水平不同,且在组织中的分布存在差异;初级免疫器官中,Th1型和Th2型细胞因子相互制衡;不同MHC单倍型鸡中细胞因子转录水平有所差异,且受日龄调节。为研究MD感染早期,细胞因子在第一道防线—肺脏和重要靶器官—脾脏中的转录水平,本试验对14日龄的G2系和G5系SPF雏鸡滴鼻接种MDV Md5细胞结合型病毒,利用dqRT-PCR方法对感染后4 h、24 h、48 h和4 d肺组织(气管)、脾脏和PBL中病毒及IFN-γ、IL-18、IL-4和IL-10的mRNA含量进行了定量检测。结果表明,4 dpi两鸡群肺脏和脾脏中均出现了MDV的转录,且肺脏中病毒转录水平高于脾脏,但尚未发生病毒血症。此时,两鸡群肺组织和脾脏中IFN-γ、IL-4和IL-10转录水平大幅度上调,且G2鸡群肺组织和脾脏中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-18的mRNA含量均高于G5。此外,G2鸡群肺脏中病毒转录水平高于G5,但脾脏中低于G5,可能是G5鸡群肺脏中的病毒比G2更早进入了脾脏中进行增殖,结合病毒检测结果和细胞因子转录水平我们推测G5系较G2系对MD易感。为能从蛋白水平研究细胞因子的分泌情况,本试验克隆并表达了鸡IL-4,利用重组蛋白免疫新西兰大白兔,大量制备了鸡IL-4多抗。以β-actin蛋白为内参,对G2、G3和G7鸡群肺组织中的IL-4蛋白含量进行了Western-blotting检测,并利用ImageQuant 5.2软件进行比较分析。结果显示,各鸡群IL-4蛋白与mRNA比较结果一致,说明该方法可用于鸡IL-4蛋白水平的半定量检测。本研究为多种免疫相关组织中细胞因子的研究提供了一定依据;在模拟MDV自然感染途径下,对早期病毒及细胞因子的检测为研究MD的致病作用提供了参考;建立的鸡IL-4蛋白分子半定量检测方法为从表达水平研究细胞因子提供了借鉴。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章引言  14-24
  1.1 研究目的及意义  14
  1.2 国内外研究现状  14-24
    1.2.1 禽免疫相关器官  14-18
    1.2.2 禽细胞因子  18-20
    1.2.3 鸡MHC单倍型与抗病性  20-21
    1.2.4 MD中的免疫反应  21-24
第二章不同单倍型G系鸡群中细胞因子转录水平的研究  24-42
  2.1 材料和方法  24-29
    2.1.1 试验动物、感受态细胞  24
    2.1.2 主要试剂  24
    2.1.3 主要仪器  24
    2.1.4 各细胞因子双重荧光定量PCR重组质粒及标准曲线的构建  24-28
    2.1.5 70 日龄5 个鸡群不同组织中细胞因子转录水平的比较  28
    2.1.6 14~70 日龄5 个鸡群PBL中细胞因子转录水平的动态分析  28
    2.1.7 35 日龄与70 日龄G2 系及G5 系SPF鸡细胞因子转录水平的的比较  28-29
    2.1.8 14~35 日龄G2 和G5 系鸡群不同组织中细胞因子转录水平动态分析  29
  2.2 结果  29-38
    2.2.1 目的基因和内参基因重组质粒的鉴定  29
    2.2.2 双重荧光定量PCR标准曲线的建立  29-30
    2.2.3 70 日龄5 个鸡群不同组织中细胞因子转录水平的比较  30-32
    2.2.4 14~70 日龄5 个鸡群PBL中细胞因子转录水平的动态分析  32-34
    2.2.5 35 日龄与70 日龄的G2 系及G5 系SPF鸡细胞因子转录水平的比较  34-36
    2.2.6 14~35 日龄G2 和G5 系鸡群不同组织中细胞因子转录水平动态分析  36-38
  2.3 讨论  38-42
    2.3.1 70 日龄5 个鸡群不同组织中细胞因子转录水平的比较  39-40
    2.3.2 14~70 日龄5 个鸡群PBL中细胞因子转录水平的比较  40
    2.3.3 35 日龄与70 日龄G2 系及G5 系SPF鸡细胞因子转录水平的比较  40
    2.3.4 14~35 日龄G2 和G5 系鸡群不同组织中细胞因子转录水平动态分析  40-42
第三章 G2 系和G5 系SPF鸡感染MDV早期的研究  42-54
  3.1 材料和方法  42-44
    3.1.1 试验动物、毒株及质粒  42
    3.1.2 主要试剂  42
    3.1.3 主要仪器  42
    3.1.4 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备  42
    3.1.5 病毒的增殖及毒株蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）的测定  42-43
    3.1.6 G2 系和G5 系SPF鸡的MDV攻毒实验  43
    3.1.7 荧光定量PCR引物及探针的合成  43
    3.1.8 meq基因双重荧光定量PCR标准曲线的构建  43-44
    3.1.9 肺脏、脾脏和PBL中病毒及细胞因子mRNA含量的定量检测  44
  3.2 结果  44-49
    3.2.1 毒株PFU的测定  44
    3.2.2 meq基因双重荧光定量PCR标准曲线的构建  44
    3.2.3 各组织中MDV转录水平的比较  44-45
    3.2.4 各组织中细胞因子的转录水平比较  45-49
  3.3 讨论  49-54
    3.3.1 关于MDV的接种方式  49-50
    3.3.2 关于MDV的检出时间  50-51
    3.3.3 IFN-γ的影响  51-52
    3.3.4 IL-18 的影响  52
    3.3.5 IL-4 和IL-10 的影响  52-53
    3.3.6 Mφ和NK细胞的影响  53-54
第四章不同B单倍型鸡群肺脏中IL-4 蛋白含量的比较  54-63
  4.1 材料和方法  54-58
    4.1.1 试验动物、感受态细胞和原核表达载体  54
    4.1.2 主要试剂  54
    4.1.3 主要仪器  54
    4.1.4 引物设计  54
    4.1.5 重组质粒pMD-IL-4 的构建  54-55
    4.1.6 重组表达质粒pET-IL-4 的构建  55-56
    4.1.7 重组蛋白的表达  56-57
    4.1.8 兔抗ChIL-4 多抗血清的制备及鉴定  57-58
    4.1.9 不同B单倍型鸡群肺脏中IL-4 的蛋白含量比较  58
  4.2 结果  58-62
    4.2.1 重组质粒pMD-IL-4 的鉴定  58-60
    4.2.2 重组表达质粒pET-IL-4 的鉴定  60
    4.2.3 重组蛋白的SDS-PAGE分析  60-61
    4.2.4 兔抗血清的免疫学鉴定  61
    4.2.5 不同B单倍型鸡群肺组织中IL-4 的蛋白含量比较  61-62
  4.3 讨论  62-63
第五章全文结论  63-64
参考文献  64-73
致谢  73-74
作者简介  74

Th1和Th2型细胞因子在不同MHC-B单倍型鸡群中的表达分析

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