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海湾扇贝近交衰退的遗传分子机理的研究

作　者: 王宇
导　师: 张国范
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 水产养殖
关键词: 海湾扇贝近交衰退偏分离表达谱
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 77次
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内容摘要

海湾扇贝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同体型贝类,行体外受精,能自体受精也能异体受精,因此可产生三种不同的交配后代：杂交(Outcross)后代、近交(Inbreeding)后代和自交(Selfing)后代。本研究利用10对多态性微卫星标记对海湾扇贝4个不同近交梯度(自交一代、自交二代、近交和杂交家系)共8个家系基因型进行了遗传分离分析。从偏分离标记的个数来看,杂家家系最多,其次是自交一代和自交二代,最后是近交家系。结果表明只有自交家系后代基因型存在纯合子缺失,发现了3个可能与有害基因连锁的微卫星标记,同时与生长性状连锁的微卫星标记在自交家系中的基因纯和率偏低,为近交衰退的遗传机理提供了参考。通过对亲本来源相同的自交扇贝和杂交扇贝闭壳肌表达谱的差异基因分析,得出杂交家系相对自交家系有1175个基因表达量上调,1390个基因表达量下调。从成分富集分析来看,两者的差别主要集中在肌原纤维、收缩纤维、细胞周边、细胞质膜和细胞连接,其中细胞质膜和细胞骨架相差的基因较多。从功能富集分析可以看出两者的功能差别主要集中在转移酶,激酶,蛋白激酶,磷酸酶,活性肽,信号转导等方面。差异比较明显的基因主要包括和闭壳肌的成分相关的有：β-微管蛋白、胶原蛋白和肌球蛋白轻链激酶、细胞质肌动蛋白；和免疫防御解毒相关的有thioester-containing protein、cathepsin L-like cysteine proteinase、半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶L和谷胱甘肽转硫酶；和氧化磷酸化相关的有Rieske铁硫蛋白、泛醌细胞色素还原酶和ATP合酶；和蛋白合成相关的有：eIF3e、转运蛋白、核糖体蛋白、hsp 90、钙结合蛋白、溶酶体保护蛋白、UDP-N-乙酰基葡萄糖转移酶好、泛素蛋白连接酶变体2和泛素C变体3；和酯类代谢相关的有鞘脂激活蛋白原和鞘脂激活蛋白A；和糖类代谢相关的有糖原磷酸化酶；和核酸代谢相关的有双功能团嘌呤合成蛋白。差异明显的通路主要集中在氧化磷酸化通路和细胞凋亡通路,和应对外界刺激。其中氧化磷酸化通路的基因在自交家系下调,这些基因包括：NADH氧化还原酶,铁硫蛋白,辅酶Q,细胞色素氧化还原酶,ATP合成酶；细胞凋亡通路相关基因在自交家系中表达量上调,这些基因包括：IKK蛋白,补体C3,IAP, Caspase 9, Caspase募集蛋白,NF-Kappa B, HSP70, HSP90, TNFR, TRAF, P53;和应对外界压力相关的基因上调,这些基因包括：转移相关蛋白(metastasis-associated protein),半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin A),组织蛋白酶L(cathepsin L), Ras家族GTP结合蛋白(Ras family GTP-binding protein),谷胱甘肽转硫酶(non-selenium glutathione preoxidase),d-LDH,eIF-2B等。以上结果说明：相对于杂交家系来说,自交家系代谢能力更弱,对外界的环境压力更为敏感,通过上调细胞凋亡和热刺激相关的基因来适应环境的变化。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第1章综述  12-30
  1.1 分子标记的开发及常用的分子标记的技术  12-14
  1.2 海湾扇贝近交家系及遗传图谱的构建  14-16
    1.2.1 海湾扇贝近交家系的建立及相关研究  14-15
    1.2.2 海湾扇贝遗传图谱的构建  15-16
  1.3 近交及近交衰退的研究进展  16-29
    1.3.1 近交及近交系数  16-18
      1.3.1.1 近交的定义及近交系数的计算  16
      1.3.1.2 近交的积极意义  16-17
      1.3.1.3 近交的消极意义  17-18
    1.3.2 近交衰退  18-20
      1.3.2.1 近交衰退的定义及近交衰退率  18
      1.3.2.2 近交衰退的机制  18
      1.3.2.3 防止近交衰退的措施  18-19
      1.3.2.4 近交衰退的研究进展  19-20
    1.3.3 研究近交衰退的手段  20-29
      1.3.3.1 分子标记的偏分离分析  20-21
      1.3.3.2 mRNA表达差异研究近交衰退  21
      1.3.3.3 数字化基因表达谱(RNA-Seq)比较分析  21-29
  1.4 本研究的目的和意义  29-30
第2章海湾扇贝杂交、近交、自交家系微卫星的偏分离分析  30-41
  2.1 材料和方法  30-33
    2.1.1 实验材料  30-31
      2.1.1.1 扇贝样品  30-31
      2.1.1.2 引物  31
      2.1.1.3 主要试剂  31
    2.1.2 实验方法  31-33
      2.1.2.1 DNA的提取方法  31-32
      2.1.2.2 引物的筛选  32
      2.1.2.3 PCR扩增  32
      2.1.2.4 PCR产物的检测  32-33
      2.1.2.5 偏分离分析的卡方检验  33
  2.2 实验结果  33-39
    2.2.1 DNA的提取及定量  33-34
    2.2.2 微卫星引物的筛选  34
    2.2.3 微卫星引物在各家系的分离情况  34-35
    2.2.4 各位点的偏分离的P值检验  35-38
    2.2.5 自交家系发生严重偏分离的标记  38
    2.2.6 生长性状连锁位点在自交家系中的子代基因纯合率分析  38-39
  2.3 讨论  39-41
第3章海湾扇贝表达谱差异基因的筛选及荧光定量PCR验证  41-61
  3.1 材料与方法  41-42
    3.1.1 实验材料  41
    3.1.2 实验试剂  41
    3.1.3 实验仪器  41-42
  3.2 实验方法  42-44
    3.2.1 表达谱的建立  42
    3.2.2 荧光定量PCR验证  42-44
      3.2.2.1 实验用品的预处理  42
      3.2.2.2 扇贝总RNA提取过程  42-43
      3.2.2.3 反转录及cDNA质量验证  43
      3.2.2.4 引物设计  43-44
      3.2.2.5 荧光定量PCR反应  44
  3.3 结果与讨论  44-58
    3.3.1 杂交家系和自交样品和参考基因比对的统计结果  44-45
    3.3.2 测序质量评估  45
    3.3.3 测序饱和度分析  45-46
    3.3.4 基因覆盖度统计  46
    3.3.5 差异基因统计图  46-47
    3.3.6 功能显著性富集分析(Gene Ontology)  47-51
    3.3.7 差异基因的筛选(FDR≤0.001,RPKM≥5和|log_2Ratio|≥1)  51-55
    3.3.8 荧光定量PCR引物设计  55-56
    3.3.9 RNA的提取结果  56
    3.3.10 cDNA及引物的检测结果  56-57
    3.3.11 部分差异基因荧光定量实验结果  57-58
  3.4 讨论与展望  58-61
参考文献  61-67
致谢  67

海湾扇贝近交衰退的遗传分子机理的研究

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