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空肠弯曲菌cheY,ciaB,dna,J,cfrA基因的克隆及其真核表达载体的构建

作　者: 王莹
导　师: 张国华；李震中
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 空肠弯曲菌 吉兰-巴雷综合征 真核表达 分子生物学 基因工程疫苗
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)作为人类的食源性病原菌,是引起急性胃肠道感染的主要病原菌之一。同时,空肠弯曲菌还与人类急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病,即吉兰-巴雷综合征(Guillain Barrésyndrome,GBS)的发生密切相关,是导致人类发生急性迟缓性瘫痪的重要病因。近年,分子生物学技术以及基因工程技术得到了长足的发展,使得人们对空肠弯曲菌在分子生物学方面的机制有了深入的研究,特别是2000年公布了C.jejuni NCTC11168 (penner O:2血清型)的全基因组序列以来,使得研究C.jejuni在分子水平的致病机制方面有了新的前景。空肠弯曲菌的致病机制主要包括侵袭、粘附、定植、产毒素,以及分子模拟等方面。已有研究表明,多种毒力因子共同参与空肠弯曲菌的致病过程。目的:本研究从基因水平出发,应用本地区已经证实的具有致吉兰-巴雷综合症特性的空肠弯曲菌血清型penner O:19 lulei菌株,选择该菌株中具有侵袭、粘附、定植及产毒素等特性的14个致病相关基因进行TA克隆,经测序后,与Genebank中C.jejuni NCTC11168中的相应基因进行比对分析,观察相似性。再选择14个基因中,保守性、免疫原性相对较强的4个基因进行克隆,并插入真核表达载体pEF neo-myc,获得真核表达,为空肠弯曲菌基因工程疫苗的研制打下基础。方法:扩增目的基因以C.jejuni penner O:19 lulei菌株为模板,用PCR的方法分别扩增grpE、dnaK、cheW、cheY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA 14个目的基因。TA克隆将14个目的基因分别连接到pGEM-T Easy载体,完成TA克隆。转化至大肠杆菌感受态Top10或DH5a。经培养后获得质粒,对质粒进行酶切后凝胶电泳检测及测序鉴定。应用DNASTAR软件与C.jejuni penner O:19 lulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相应基因进行比对分析,得到相似指数。构建真核表达载体选择14个目的基因中,保守性、免疫原性较强的4个基因cheY、ciaB、dnaJ、cfrA,用Pyrobest PCR的方法扩增4个基因后,应用真核质粒载体pEF neo-myc,以KpnⅠ和EcoRⅤ,或KpnⅠ和SpeⅠ为酶切位点,分别构建真核表达载体。经转化大肠杆菌感受态,得到质粒并测序成功后,转染293T细胞。转染成功后用Western Blotting的方法检测蛋白的表达。结果:成功扩增并TA克隆出目的基因grpE、dnaK、cheW、cheY、cheV、flaA、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ,由于基因cfrA片段长度太大,将其分成两段进行扩增并TA克隆。转化大肠杆菌感受态并培养后,所得质粒经凝胶电泳检测,并测序鉴定后,应用DNASTAR软件与C.jejuni penner O:19 lulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相应基因进行比对分析。所得目的基因与C.jejuni penner O:19 lulei菌株DNA序列相同;与C.jejuni NCTC11168比对,得出结果:基因dnaK、cheW、cheY、cheV、cdtA、cdtB、cdtC、peb2、pebC、ciaB、dnaJ、cfrA-1的相似指数分别在95.1%-100%,flaA的相似指数为92.6%,grpE的相似指数为89.9%,cfrA-2的相似指数<50%。应用真核质粒载体pEF neo-myc,成功构建了基因cheY、ciaB、dnaJ及cfrA的真核表达载体。用Western Blotting的方法检测到CheY′,CiaB′及DanJ′蛋白的表达,但未检测到CfrA-1′,CfrA-2′蛋白的表达。结论:成功扩增并TA克隆出与空肠弯曲菌侵袭、粘附、定植及产毒素等特性相关的14个致病相关基因。应用DNASTAR软件与C.jejuni penner O:19 lulei菌株DNA序列及NCTC11168中的相应基因进行比对分析,大部分基因相似指数较高,说明基因相对保守。对保守性、免疫原性相对较强的4个基因进行真核表达,获得真核表达载体,为后续空肠弯曲菌基因工程疫苗的研制打下基础。

全文目录


摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-10
材料与方法  10-24
结果  24-27
附图  27-43
附表  43-48
讨论  48-50
结论  50
参考文献  50-54
综述 空肠弯曲菌致病力及其致病相关基因的研究现状  54-65
  参考文献  60-65
致谢  65-66
个人简历  66-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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