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去类泛素化酶SENP2的克隆、表达、纯化及活性研究

作　者: 关威
导　师: 房学迅
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 可溶表达 SUMO Ubiquitin 融合标签 SENP2
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


尽管现在有多种多样的蛋白表达系统可供选择,但是重组蛋白在大肠杆菌中的可溶表达仍然是困扰大家的一个难题,所以我们需要针对难以可溶表达的蛋白建立一种好的表达系统。随着对大肠杆菌中蛋白质折叠机制的深入研究,目前已经找到了一些提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法。其中,融合表达策略是最常用的方法之一。在本论文中,我们进行了一种人SUMO融合表达系统在促蛋白可溶性方面的研究。通过利用两种不同的靶蛋白,分别为具有不溶性倾向的基质金属蛋白酶13(MMP-13)和具有中度可溶性的绿色荧光蛋白(GFP)。绿色荧光蛋白(GFP)是一种被广泛使用的体内表达报告基因,并且公认为在大肠杆菌中表达时具有部分可溶性,通过构建带有融合标签的载体提高靶蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的情况的鉴定,发现人SUMO是一种非常有效的蛋白可溶性标签。对SUMO化酶SENP2进行克隆表达纯化,对融合表达系统所表达的融合蛋白进行了纯化,并对所构建的融合蛋白进行了特异性的切割。获得了高度均一的、有活性的靶蛋白。当传统的技术不能获得有效的表达可溶蛋白的时候,实验室所构建的pHSE1、pHSE2可溶表达系统和去类泛素化酶联合使用将会取得一定的效果。

全文目录


内容提要  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
英文缩写一览表  10-13
第一章 前言  13-24
  1.1 可溶表达载体的研究意义  13-14
    1.1.1 传统的包涵体蛋白复性的局限性  13-14
    1.1.2 传统的pET表达系统简介  14
  1.2 可溶表达载体的研究现状  14-18
    1.2.1 现有的促可溶表达技术简介  14-16
    1.2.2 融合技术的优点  16-17
    1.2.3 融合技术的缺点  17-18
  1.3 SUMO、Ub融合标签简介  18-21
    1.3.1 SUMO融合标签  18-20
    1.3.2 Ub融合标签  20
    1.3.3 SUMO、Ub融合表达系统的优势  20-21
  1.4 载体特异性酶SENP2简介  21-22
    1.4.1 SUMO化与去SUMO化  21
    1.4.2 去SUMO化酶SENP2简介  21-22
  1.5 本论文研究目的和策略  22-24
    1.5.1 研究目的  22-23
    1.5.2 研究策略  23-24
第二章 促可溶表达载体的研究  24-41
  2.1 材料和设备  24-26
    2.1.1 实验所需药品与所使用的试剂  24-25
    2.1.2 实验所需的主要仪器和设备  25
    2.1.3 实验所使用的主要溶液的配制方法  25-26
  2.2 主要实验方法  26-41
    2.2.1 实验设计思路  26-27
    2.2.2 可溶表达载体的构建方法  27-28
    2.2.3 可溶表达载体的构建过程  28-33
    2.2.4 可溶表达载体的促可溶情况研究  33-34
    2.2.5 可溶载体所表达的融合蛋白的纯化  34-35
    2.2.6 结果与讨论  35-41
第三章 可溶表达载体的特异性酶SENP2的克隆、表达、纯化以及活性研究  41-56
  3.1 实验材料和仪器  41-42
    3.1.1 主要试剂  41-42
    3.1.2 实验所需的主要仪器和设备  42
    3.1.3 实验所使用的主要溶液的配制方法  42
  3.2 可溶表达载体特异性酶SENP2的克隆  42-47
    3.2.1 目的基因的获取  42-44
    3.2.2 目的基因克隆  44-47
  3.3 特异性酶SENP2的表达、纯化  47-48
    3.3.1 特异性酶SENP2的表达  47
    3.3.2 特异性酶SENP2的纯化  47-48
  3.4 SENP2活性研究  48-49
    3.4.1 去SUMO化酶SENP2切割融合蛋白  48
    3.4.2 成熟蛋白eGFP和MMP-13的纯化  48-49
    3.4.3 特异性酶SENP2的活性研究  49
  3.5 结果与讨论  49-56
    3.5.1 SENP2的克隆  49-52
    3.5.2、SENP2的表达、纯化  52-53
    3.5.3 SENP2特异性酶活性分析  53-56
结论  56-58
参考文献  58-63
致谢  63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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