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DEC1的SUMO化修饰及其相关功能的研究

作　者: 洪永德
导　师: 伍会健
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DEC1 SUMO CLOCK/BMAL1 HDAC1 基因表达
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 96次
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内容摘要

软骨分化的表达基因1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed genel,DEC1)属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix,bHLH)家族。DEC1作为一个转录因子在基因表达调控过程中起着非常重要的作用,而且广泛地参与了核受体信号通路,HIF(hypoxia-inducible factor)信号通路和p53信号通路并且影响了细胞的生长,增殖以及分化等过程。另外,DEC1与乳腺癌的发生和发展也密切相关。研究发现,DEC1作为一个时钟蛋白,其自身的表达具有一定的周期节律性,并且参与了对时钟基因的表达调控过程。在哺乳动物的分子钟系统中,DEC1通过与时钟基因启动子上的E-box作用元件(CACGTG)结合后抑制由CLOCK/BMAL1异二聚体介导的转录激活过程。尽管,DEC1参与了时钟基因的周期调控过程,但是具体的分子调控机制还不是很清楚。SUMO化修饰作为一种重要的翻译后修饰对蛋白质的功能有广泛的调节作用,包括蛋白质的细胞定位,蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的活性等方面。因此,本文的主要研究内容就是确定DEC1的SUMO化修饰以及SUMO化修饰对DEC1功能的影响。首先,在COS-7细胞中确定了外源转染的DEC1能够被SUMO1,2以及3修饰,并且与SUMO2和SUMO3相比,DECl更易于被SUMO1修饰。另外,在乳腺癌细胞MCF-7细胞系中利用免疫共沉淀的方法同样证实了内源的DEC1可以被SUMO1修饰；其次,对DEC1的氨基酸序列分析后发现,在其C末端的K159和K279是两个潜在的与SUMO分子结合的赖氨酸残基。随后,在COS-7细胞中利用定点突变技术构建DEC1的SUMO化位点突变的突变体,即K159R, K279R和2K/2R(将两个赖氨酸同时突变为精氨酸)做免疫印记实验后发现,K159和K279是DEC1的两个主要的SUMO化位点。另外,K279R突变体对DEC1的SUMO化修饰水平的影响比K159R突变体明显。最后,在MCF-7细胞中利用免疫荧光实验和核质分离实验发现,将DEC1的SUMO化位点突变后能够导致细胞核中的DEC1向细胞质中转移,同时降低了DEC1在细胞核中的蛋白水平,值得注意的是,DEC1的SUMO化位点突变体与野生型DEC1相比在细胞质与细胞核中的蛋白总量也有一定程度的降低,暗示了,SUMO化修饰对DEC1的稳定性也是非常重要的。另外,在MCF-7细胞中利用荧光素酶报告基因实验以及免疫共沉淀实验发现,DEC1的SUMO化通过提高DEC1与HDAC1之间相互作用来抑制由CLOCK/BMAL1介导的转录激活过程。本研究主要证实了,DEC1能够被SUMO化修饰并且促进了DEC1在细胞核中的定位。另外,在乳腺癌细胞中SUMO化修饰通过影响DEC1招募HDAC1的水平来调节核心时钟蛋白CLOCK介导的基因表达过程,这就为进一步的了解乳腺癌的发生以及生物钟调控的分子机制提供了重要的理论基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 文献综述  13-29
  1.1 时钟蛋白DEC1概述  13-21
    1.1.1 DEC1的基本结构  13-14
    1.1.2 DEC1参与的信号通路  14-18
    1.1.3 DEC1与时钟周期  18-21
  1.2 SUMO与SUMO化修饰  21-27
    1.2.1 SUMO蛋白家族  21-22
    1.2.2 SUMO化修饰的分子机制  22-24
    1.2.3 SUMO化修饰的功能  24-27
  1.3 本论文的选题依据和研究内容  27-29
    1.3.1 选题依据  27
    1.3.2 研究内容  27-29
2 细胞内DEC1的SUMO化修饰  29-39
  2.1 引言  29
  2.2 仪器与试剂  29-32
    2.2.1 仪器  29-30
    2.2.2 试剂  30-32
  2.3 实验方法  32-35
    2.3.1 细胞培养  32
    2.3.2 质粒表达载体的细胞转染  32-33
    2.3.3 Western blotting(WB)实验  33-34
    2.3.4 免疫共沉淀(IP)实验  34-35
  2.4 结果与讨论  35-38
    2.4.1 COS-7细胞中外源转染DEC1的SUMO化修饰  35-37
    2.4.2 MCF-7细胞中内源DEC1的SUMO化修饰  37-38
  2.5 小结  38-39
3 K159和K279是DEC1的主要SUMO化位点  39-47
  3.1 引言  39
  3.2 仪器与试剂  39-41
    3.2.1 仪器  39
    3.2.2 试剂  39-41
  3.3 实验方法  41-43
    3.3.1 DEC1定点突变体的构建  41-42
    3.3.2 突变体的质粒转化  42
    3.3.3 质粒提取  42
    3.3.4 细胞培养  42-43
    3.3.5 质粒表达载体的细胞转染  43
    3.3.6 Western blotting实验  43
    3.3.7 蛋白质定量实验(考马斯亮蓝法)  43
  3.4 结果与讨论  43-46
    3.4.1 DEC1的定点突变体在COS-7细胞中的表达  43-44
    3.4.2 K159和K279是DEC1的主要SUMO化位点  44-46
  3.5 小结  46-47
4 SUMO化修饰对时钟蛋白DEC1功能的调控  47-56
  4.1 引言  47
  4.2 仪器与试剂  47-48
    4.2.1 仪器  47
    4.2.2 试剂  47-48
  4.3 实验方法  48-50
    4.3.1 细胞培养  48
    4.3.2 质粒表达载体的细胞转染  48
    4.3.3 免疫荧光实验  48-49
    4.3.4 核质分离实验  49-50
    4.3.5 Western blotting实验  50
    4.3.6 IP实验  50
    4.3.7 荧光素酶报告基因实验  50
  4.4 结果与讨论  50-55
    4.4.1 SUMO化修饰促进了DEC1的细胞核定位  50-52
    4.4.2 DEC1的SUMO化抑制CLOCK/BMAL1介导的转录  52-55
  4.5 小结  55-56
结论  56-58
参考文献  58-64
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  64-65
致谢  65-66

DEC1的SUMO化修饰及其相关功能的研究

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