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硫酸软骨素酶ABC对大鼠脑损伤（TBI）模型胶质瘢痕影响的实验研究

作　者: 洪怡瑜
导　师: 姜晓丹
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经外科学
关键词: 创伤性颅脑损伤胶质瘢痕硫酸软骨素酶
分类号: R651.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是公认的多发病及难愈的伤病之一,具有高致残率、高耗费、高死亡率等特点。目前在应用各种治疗方法的幸存者中,有大约75%的病员呈不同程度劳动能力丧失,其中重度致残者约占40%,对家庭、社会均造成沉重负担。如何有效地修复脑损伤,迄今为止尚无满意有效的对策,究其原因主要在于已成熟的中枢神经再生困难。然而,随着医学科学的进步,近年来对中枢神经系统(central nervous system, CNS)神经再生的一系列实验研究成果为脑损伤后神经再生带来了新的希望。目前人们对于脑组织损伤后神经再生的认识包括以下几个方面：1、神经细胞本身不能再生,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)、胚胎组织或其它移植的细胞能否向脑神经细胞转化进而修复脑损伤尚研究阶段。2、胶质细胞可以再生,并且在损伤后会大量增生,试图“修复”损伤,但大量的胶质细胞增生形成胶质瘢痕,反成为轴突再生的障碍。3、轴突在脑损伤后的再生能力,虽然受到诸多因素(包括抑制因子存在等)影响,但还是具备再生的能力。许多新的方法如神经移植包括周围神经移植、NSCs移植、嗅鞘细胞移植、基因治疗等均可使成年动物受损伤的脑组织表现出某种程度的功能恢复。脑损伤后会启动一系列与形成瘢痕组织相关的细胞及分子间的反应,形成以星形胶质细胞为主的瘢痕组织,这种致密的胶质瘢痕包囊脑的损伤区从而把脑损伤区与正常脑组织隔开,使再生的神经轴突不能越过损伤区的胶质瘢痕,造成再生的神经轴突不能与突触后神经元建立功能性链接；同时星形胶质细胞分泌的蛋白多糖即硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans, CSPGs)在损伤区的堆积也是抑制神经再生的重要原因。所以,胶质瘢痕组织是导致脑组织神经难以再生的主要原因之一。研究证实,CSPGs有非常强的抑制轴突再生功能,而作为细菌胞外裂解酶的硫酸软骨素酶ABC (chondroitin sulfate enzyme ABC, chABC)则可以通过干预CSPGs对神经修复的抑制作用而减少神经胶质瘢痕,促进神经再生。本课题研究主要内容是：使用自由落体撞击法建立脑损伤胶质瘢痕的动物模型,并依照分组条件在治疗组的动物损伤点上即时注射不同浓度的chABC;在此后的1周、2周及4周三个时间点取出各组脑组织标本,行镜下比较观察各组(包括正常组、模型组对照组、治疗组)的损伤点星形胶质细胞聚集程度以了解瘢痕组织生长情况,并以免疫组化和蛋白印迹观察CSPGs及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达情况,以判断去瘢痕的治疗效果。第一部分大鼠脑损伤后胶质瘢痕模型的制作目的：构建大鼠脑损伤胶质瘢痕模型,为后续进一步对去瘢痕组织治疗研究奠定基础。方法：wistar大鼠随机分为4组,每组9只,分别为模型对照组、治疗组1(1U/ml ChABC)、治疗组2(2.5U/ml ChABC)、治疗组3(5U/ml ChABC);另还有2只为正常对照组。采用改进的Feeney法按自由落体原理制造成大鼠重度TBI模型。撞击锤重20 g,下落高度30 cm,落体致伤的冲击力为20×30 g·cm。将大鼠头部固定于立体头架上,沿头皮中线矢状位切开皮肤约2 cm,然后逐层切开皮下筋膜,分离骨膜至颅骨,以前囱尾侧2mm、矢状缝左侧2mm的左侧大脑皮质后肢运动区域为中心,开一直径为5mm的圆形骨窗,硬膜保持完整。20 g撞击捶从30cm高的外周套管下落,撞击已置于骨窗硬膜上的撞杆；撞击伤后,充分止血即缝合头皮。治疗组则即时在损伤点注射不同浓度的chABC。结果：以Feeney自由落体撞击法建立了重度大鼠TBI模型,为大鼠TBI形成胶质瘢痕提供了研究客体。结论：用自由落体撞击法建立脑损伤胶质瘢痕形成模型,脑损伤确切,具备胶质瘢痕形成的条件。第二部分大鼠脑损伤后胶质瘢痕的形态学确认目的：观察星形胶质细胞聚集,并初步确定异常组织胶质瘢痕的形成及其范围。方法：自由落体撞击法后,将脑损伤的大鼠饲养1周以上,以予损伤脑组织的瘢痕组织充分生长。分别在大鼠TBI后的第1周、2周及4周三个时间点灌注固定并取出大鼠脑组织,病理学检测,确定异常的胶质瘢痕组织。结果：在三个时间点,各组均能清晰呈示出损伤点处的星形胶质细胞异常聚集,与正常脑组织之间边界清晰,且在TBI后第2周及4周的模型对照组鼠标本中,星形胶质细胞的异常聚集程度较1周更加明显,但2周和4周时间点之间的胶质细胞聚集程度没有明显差异变化。相对于模型对照组而言,三个治疗组的星形胶质细胞异常聚集明显减少。结论：本实验条件下,大鼠TBI后的第1周,即出现胶质瘢痕；受损伤的脑组织与正常脑组织之间在星形胶质细胞聚集程度上差别明显。第三部分硫酸软骨素酶ABC对脑损伤模型胶质瘢痕的影响目的：比较观察ChABC对脑损伤胶质瘢痕的影响。方法：各组标本根据免疫组化和蛋白印迹的不同要求,分别行4%多聚甲醛灌注和冰冻保存。其中多聚甲醛灌注后的标本经石蜡包埋、切片、脱蜡、及常规免疫组化检测CSPGs、GFAP分布情况；而用于检测蛋白印迹的冰冻标本,则经过蛋白提取和变性、胶的制作、点样、电泳、转膜、封闭、ECL检测,暗室曝光等操作后,观察CSPGs、GFAP表达情况。结果：模型对照组CSPGs免疫组化染色后的脑损伤组织切片上,可清晰观察到胶质瘢痕组织呈淡黄色,胶质组织较正常脑组织染色深,边界清晰。而治疗组CSPGs免疫组化染色后的脑损伤切片,则淡黄色阳性结构较模型对照组明显减少,与正常组织边界模糊,其中以第3治疗组(5U/m1)最为明显。蛋白印迹的的检测提示5U/ml治疗组CSPGs表达较其它治疗组及模型对照组明显减少。结论：经chABC治疗后的脑损伤在CSPGs的表达方面较未治疗组明显减少,且以5U/ml治疗组CSPGs表达减少最为明显。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
研究背景  13-18
  参考文献  15-18
第一部分大鼠脑损伤胶质瘢痕模型的建立  18-25
  1 引言  18
  2 材料  18-19
  3 方法  19-21
  4 结果  21
  5 讨论  21-23
  6 结论  23
  参考文献  23-24
  附图  24-25
第二部分大鼠脑损伤后胶质瘢痕的形态学确认  25-35
  1 引言  25-26
  2 材料  26-27
  3 方法  27-29
  4 结果  29
  5 讨论  29-30
  6 结论  30
  参考文献  30-33
  附图  33-35
第三部分硫酸软骨素酶ABC对脑损伤模型胶质瘢痕的影响  35-53
  1 引言  35-36
  2 材料  36-38
  3 方法  38-42
  4 结果  42-44
  5 讨论  44-45
  6 结论  45-46
  参考文献  46-48
  附图  48-53
全文总结  53-54
综述  54-59
  参考文献  57-59
中英文名词对照与缩写  59-61
在读期间论文发表情况  61-62
致谢  62-64
统计学证明  64

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脑损伤（TBI）模型胶质瘢痕影响的实验研究

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