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萝芙木MCT、HDS、SGD基因的克隆与遗传转化体系的建立

作　者: 郑月
导　师: 廖志华；陈敏
学　校: 西南大学
专　业: 遗传学
关键词: 萝芙木萜类吲哚生物碱 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶异胡豆苷-β-D-糖苷酶遗传转化阿玛碱
分类号: S567.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

萝芙木(Rauvolfia verticillata L.)是一类重要的生产萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole Alkolids, TIAs)的夹竹桃科木本植物,如今已经从其中分离到了超过90种生物碱,包括治疗高血压的阿玛碱、利血平,以及治疗男性不育和动脉硬化的育亨宾等。但天然药源萝芙木中生物碱的含量很低,目前萝芙木的生产远远不能满足国际市场的需求。化学合成阿玛碱、利血平等生物碱成本高、毒性大,所以不能应用于生产。近年来,随着萜类吲哚生物碱生物合成途径相关酶基因的克隆,基因工程成为提高阿玛碱含量的有效途径之一。为了研究阿玛碱生物合成的分子机理和为萜类吲哚生物碱代谢工程提供新的靶点,本研究采用RACE技术从萝芙木中首次克隆获得了阿玛碱合成途径中的三个关键酶基因：2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase, MCT;EC:2.7.7.60)基因、羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase, HDS; EC:1.17.4.3)基因和异胡豆苷-β-D-糖苷酶(scrictosidine-β-glucosidase, SGD;EC:3.2.1.105)基因,并进行了相应的生物信息学分析。此外,本研究还建立了萝芙木的高效再生体系和发根遗传转化体系,从而为在萝芙木中开展代谢工程研究奠定了基础。MCT是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径途径上的第三个酶,催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸和CDP缩合成4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇(4-(cytidine 5-diphospho)-2-C-methylerythritol, CDP-ME)。本研究采用RACE技术,从萝芙木中克隆了MCT基因的全长cDNA,命名为RvMCT(GenBank登录号为：JF966732)。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长1524 bp,包含945 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码314个氨基酸残基蛋白质,其理论分子量为34.45 kDa,等电点为7.34,TargetP软件预测其N端存在质体转运肽。蛋白质序列比对分析显示,RvMCT蛋白与其它物种的MCT蛋白具有同源性,尤其与植物来源的MCT具有高度同源性,与长春花(Catharanthus roseus)MCT相似性达到了84.1%。生物信息学分析预测RvMCT蛋白质二级结构由52.87%的随意卷曲、15.61%的片层和31.53%的α-螺旋组成。将RvMCT与来源于植物、细菌的MCTs构建分子进化树,结果表明MCTs在进化树上按照各自所属类群分为3大枝：细菌、裸子植物和被子植物,RvMCT聚到被子植物的一枝,且与长春花MCT亲缘关系最接近。利用荧光定量PCR对RvMCT进行组织表达谱分析结果表明RvMCT在嫩叶中的表达量最高,其次是老叶、树皮、根和茎。HDS催化2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸(ME-cPP)转化生成羟甲基丁烯基-4-磷酸(HMBPP),是MEP途径中的倒数第二个酶。本研究采用RACE技术,从萝芙木中克隆获得了HDS基因的全长cDNA,并命名为RvHDS(GenBank登录号为：HQ659759)。该基因cDNA全长2645 bp,包含2223 bp的开放式阅读框,编码740个氨基酸残基的蛋白,其电子预测分子量为82 kDa,等电点预测为6.28。生物信息学分析显示,RvHDS与来源于其他物种的HDS蛋白序列同源,尤其是与植物来源的HDS高度同源,在N端有质体转运肽。RvHDS序列包含HDS蛋白典型的Cys-270、Cys-273、Cys-305氨酸残基活性位点,这三个氨基酸残基被认为是HDS蛋白催化区域中最保守的三个位点。对来源于不同物种中的HDSs构建进化树表明,HDSs在进化树上聚为3枝,RvHDS聚到植物的一枝且与长春花HDS的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明RvHDS在老叶中表达量最高,其次是树皮、嫩叶、根和茎。SGD催化TIAs合成途径中的通用前体异胡豆苷进行去糖基化反应,此步反应促使了TIAs在不同物种中的多样性。本研究采用RACE技术,从萝芙木中克隆获得了SGD的全长cDNA,并命名为RvSGD(GenBank登录号为：JF966733)。该基因cDNA全长1859 bp,包含1608bp的开放阅读框,编码536个氨基酸,其电子预测分子量为61 kDa,等电点pI为6.16。生物信息学分析显示,RvSGD与蛇根木SGD及长春花SGD的序列相似性分别高达90.1%和70.9%,RvSGD也具有SGD蛋白的三个保守的氨基酸催化位点His-161,Glu-207和Glu-419。荧光定量PCR表明RvSGD在树皮中表达量最高,其次是老叶、根、嫩叶和茎。对RvMCT、RvHDS和RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这三个基因在TIAs的生物合成中的作用,并为今后调控TIAs的生物合成提供了新的靶点。随着基因克隆及生物合成途径的阐明,代谢工程被认为是提高萜类吲哚生物碱含量的有效途径。通过遗传转化获得高产TIAs的转基因植株或发根从而解决TIAs原料短缺是一种可行的方法。然而转基因工作的进行必须依赖于植物高效再生体系的建立或毛状根遗传体系的建立,萝芙木是一种木本植物,再生和遗传转化相对困难。为了给后续开展萝芙木转基因研究奠定基础,本文对萝芙木植株再生体系和发根转化体系分别进行了研究。研究结果表明,以萝芙木茎段作为外植体,先在添加了0.8 mg/L IBA的1/2MS培养基上培养,后转至添加2.0mg/L 6-BA和0.05 mg/L NAA培养基上可以高效再生出萝芙木植株。通过农杆菌C58C1的侵染建立了萝芙木发根转化体系,并用HPLC方法检测了发根中阿玛碱的含量为170.99μg/g。本文的研究对今后在萝芙木中开展TIAs的代谢工程研究奠定了基础和提供了参考。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 背景概况  12
  1.2 萝芙木概况  12-13
  1.3 萝芙木组织培养技术概况  13-15
    1.3.1 器官发生途径  14
    1.3.2 体细胞胚发生途径  14
    1.3.3 农杆菌介导的遗传转化途径  14-15
  1.4 萝芙木TIAs合成途径  15-16
  1.5 萝芙木TIAs合成途径中的关键酶基因  16-20
    1.5.1 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)  16-17
    1.5.2 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)  17
    1.5.3 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)  17
    1.5.4 2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MECS)  17-18
    1.5.5 羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶(HDS)  18
    1.5.6 羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶(HDR)  18
    1.5.7 色氨酸脱羧酶(TDC)  18-19
    1.5.8 香叶醇-10-脱氢酶(G10H)  19
    1.5.9 次番木鳖苷合成酶(SLS)  19-20
    1.5.10 异胡豆苷合成酶(STR)  20
    1.5.11 异胡豆苷-β-葡萄糖苷酶(SGD)  20
  1.6 萜类吲哚生物碱的代谢工程  20-22
第二章绪论  22-24
  2.1 研究目的和意义  22
  2.2 研究范围和内容  22-23
  2.3 技术路线  23-24
第三章材料与方法  24-40
  3.1 植物材料  24
  3.2 菌株和质粒  24
  3.3 仪器和设备  24
  3.4 试剂盒及试剂  24
  3.5 自配试剂  24-25
  3.6 常规方法介绍  25-27
    3.6.1 RNA的提取  25-26
    3.6.2 DNA产物的琼脂糖凝胶电泳  26
    3.6.3 目的条带的回收  26
    3.6.4 目的片段与克隆载体T连接  26-27
    3.6.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl_2法)  27
    3.6.6 连接反应物转化大肠杆菌感受态细胞  27
  3.7 RvMCT、RvHDS和RvSGD基因的克隆与分析  27-35
    3.7.1 从萝芙木总RNA合成第一链cDNA  28
    3.7.2 RvMCT、RvHDS和RvSGD基因的克隆  28-33
    3.7.3 RvMCT、RvHDS和RvSGD基因的生物信息学分析  33
    3.7.4 RvMCT、RvHDS和RvSGD基因的组织表达谱分析  33-35
  3.8 萝芙木高效再生体系的建立  35-36
    3.8.1 萝芙木无菌苗快繁体系的建立  35
    3.8.2 萝芙木愈伤组织的诱导  35
    3.8.3 萝芙木悬浮细胞体系的建立  35
    3.8.4 萝芙木愈伤组织的再生  35-36
  3.9 萝芙木发根遗传体系的建立  36-40
    3.9.1 发根农杆菌C58C1的活化  36
    3.9.2 发根农杆菌C58C1转化萝芙木外植体  36
    3.9.3 萝芙木发根的PCR鉴定  36-37
    3.9.4 萝芙木发根中阿玛碱含量的检测  37-40
第四章结果与分析  40-62
  4.1 RvMCT基因的获得和分析  40-45
    4.1.1 RvMCT基因的获得  40-41
    4.1.2 RvMCT基因的生物信息学分析  41-45
    4.1.3 RvMCT基因的组织表达谱分析  45
  4.2 RvHDS基因的获得和分析  45-51
    4.2.1 RvHDS基因的获得  45-46
    4.2.2 RvHDS基因的生物信息学分析  46-51
    4.2.3 RvHDS基因的组织表达谱分析  51
  4.3 RvSGD基因的获得和分析  51-55
    4.3.1 RvSGD基因的获得  51-52
    4.3.2 RvSGD基因的生物信息学分析  52-55
    4.3.3 RvSGD基因的组织表达谱分析  55
  4.4 萝芙木高效再生体系的建立  55-57
    4.4.1 萝芙木无菌苗体系的建立  55
    4.4.2 萝芙木愈伤组织的诱导  55-56
    4.4.3 萝芙木愈伤组织的植株再生  56-57
  4.5 萝芙木发根遗传体系的建立  57-60
    4.5.1 萝芙木发根的诱导  57-59
    4.5.2 萝芙木发根中阿玛碱含量的检测  59-60
  4.6 结论与展望  60-62
参考文献  62-68
附录  68-72
  缩略词表  68-70
  攻读硕士学位期间发表的论文  70-72
致谢  72-73

萝芙木MCT、HDS、SGD基因的克隆与遗传转化体系的建立

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