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重组肺炎克雷伯氏菌及代谢产物分析

作　者: 王冠凤
导　师: 包永明
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 肺炎克雷伯氏菌 丁二酮 2，3-丁二醇氧化还原酶 α-乙酰乳酸合成酶
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 125次
引　用: 1次
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内容摘要


丁二酮天然存在于月桂油、草莓、奶油、樱桃、蜂蜜、啤酒等物质中,是国家规定允许使用的食品香料。丁二酮产率不高是限制微生物发酵生产丁二酮发展的重要因素。运用分子生物学的手段对菌种进行改造,是提高微生物转化丁二酮产量的重要方法。2,3-丁二醇氧化还原酶是催化丁二酮生物分解代谢的唯一一个酶,而a-乙酰乳酸合成酶是丁二酮生物合成途径中涉及到的第一个酶,也是控制丙酮酸分解的关键性限速酶,这两种酶对丁二酮的产量起着至关重要的作用。本论文的研究目的是通过改造肺炎克雷伯氏菌中编码2,3-丁二醇氧化还原酶的基因和编码α-乙酰乳酸合成酶的基因,从而利用基因工程手段实现丁二酮的生物合成,有望提高丁二酮的产量。本文利用重叠拼接PCR技术构建了含有四环素抗性基因Tcr的同源重组线性片段up-5’budC-Tcr-3’budC-down,电转化K.pneumoniae CICC10011感受态细胞,利用同源重组双交换原理,将重组片段定点插入到染色体2,3-丁二醇氧化还原酶的基因budC+153～+604区(budC起始编码框为+1)位点上,获得了具有四环素抗性的budC-突变株,命名为重组菌株K. pneumoniae CICC10011-0。通过葡萄糖摇瓶发酵实验,利用气相色谱分析代谢产物,结果表明,相同发酵条件下,野生菌不产丁二酮,重组菌株CICC10011-0的丁二酮产量达到0.14g/1,重组菌株CICC10011-0比野生菌的葡萄糖利用率低81.25%,3-羟基丁酮、2,3-丁二醇和乙醇产量均下降了约100%,乙酸产量提高了209.33%,达5.67g/1。以Klebsiella pneumoniae CICC10011基因组为模板,利用PCR技术扩增得到α-乙酰乳酸合成酶的基因als,将其连接到表达载体pBR322上。通过电击转化的方法,将重组质粒pBR-322-als导入Klebsiella pneumoniae CICC10011,构建过量表达编码α-乙酰乳酸合成酶基因的工程菌,命名为重组菌株Klebsiella pneumoniae CICC10011-1。通过葡萄糖摇瓶发酵实验,α-乙酰乳酸合成酶活分析,发现重组菌株CICC10011-1的α-乙酰乳酸合成酶的比酶活为0.6367U/mg蛋白,是出发菌株CICC 10011的3倍；利用气相色谱测定代谢产物量,结果表明,重组菌株CICC10011-1与野生菌都不产丁二酮,3-羟基丁酮和2,3-丁二醇的浓度与野生菌相比均有所提高,乙醇和乙酸的浓度均有所降低。综上,在Klebsiella pneumoniae CICC10011胞内代谢中,丁二酮对α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶可能起到反馈抑制作用；α-乙酰乳酸合成酶并不是丁二酮、3-羟基丁酮和2,3-丁二醇生成的关键调控点。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-12
1 文献综述  12-29
  1.1 丁二酮概况  12-14
    1.1.1 丁二酮理化性质  12
    1.1.2 丁二酮的应用  12
    1.1.3 丁二酮的生产现状  12-14
  1.2 微生物发酵法生产丁二酮的研究进展  14-22
    1.2.1 微生物发酵法生产丁二酮的菌种  14-15
    1.2.2 微生物发酵法生产丁二酮的底物  15-16
    1.2.3 微生物发酵法生产丁二酮的代谢途径  16-18
    1.2.4 丁二酮合成关键酶以及基因的研究  18-19
    1.2.5 发酵液中产物的检测  19-22
    1.2.6 微生物发酵法生产丁二酮存在的问题  22
  1.3 通过基因敲除技术构建合成丁二酮的工程菌  22-27
    1.3.1 概述  22-23
    1.3.2 基因敲除技术的原理及方法  23-25
    1.3.3 基因敲除技术的应用及前景  25-26
    1.3.4 基因敲除技术的缺陷  26-27
  1.4 过量表达关键酶基因工程菌的构建  27
  1.5 本论文的立题依据和研究内容  27-29
2 2,3-丁二醇氧化还原酶基因敲除重组菌的构建及鉴定  29-57
  2.1 引言  29
  2.2 实验材料和仪器  29-33
    2.2.1 菌株和质粒  29
    2.2.2 引物  29-30
    2.2.3 主要试剂  30-31
    2.2.4 仪器  31-32
    2.2.5 常用培养基  32
    2.2.6 常用溶液的配制  32-33
  2.3 实验方法  33-44
    2.3.1 Klebsiella pneumoniae CICC10011耐药性分析  33
    2.3.2 Klebsiella pneumoniae CICC10011基因组DNA的提取  33
    2.3.3 bud C基因片段的克隆  33-35
    2.3.4 待融合片段的独立扩增  35-38
    2.3.5 融合片段的全长扩增及鉴定  38-40
    2.3.6 电转化  40-41
    2.3.7 重组菌的验证  41-44
  2.4 实验结果与讨论  44-56
    2.4.1 基因敲除标记的选取  44
    2.4.2 budC基因片段的克隆  44-48
    2.4.3 同源重组线性DNA片段的获得  48-50
    2.4.4 重组菌的验证  50-56
  2.5 小结  56-57
3 过量表达α-乙酰乳酸合成酶基因菌株的构建和鉴定  57-69
  3.1 引言  57
  3.2 实验材料和仪器  57-58
    3.2.1 菌株和质粒  57
    3.2.2 引物  57
    3.2.3 主要试剂  57-58
    3.2.4 仪器  58
    3.2.5 常用培养基  58
    3.2.6 常用溶液的配制  58
  3.3 实验方法  58-60
    3.3.1 重组菌株的构建  58-59
    3.3.2 菌体浓度测定  59
    3.3.4 底物葡萄糖及代谢产物浓度测定  59-60
    3.3.5 α-乙酰乳酸合成酶酶活测定  60
  3.4 实验结果与讨论  60-68
    3.4.1 als基因鉴定  60-61
    3.4.2 重组质粒pBR322-als的构建及酶切鉴定  61-62
    3.4.3 重组菌株K.pneumoniae CICC10011-1的构建和初步鉴定  62-63
    3.4.4 α-乙酰乳酸合成酶活分析  63-64
    3.4.5 重组菌株K.pneumoniae CICC10011-1生长代谢特性研究  64-68
  3.5 小结  68-69
结论  69-70
参考文献  70-74
附录A 设计合成基因敲除片段的引物  74-75
附录B 标准物校正因子计算  75-76
附录C als基因核苷酸序列图谱  76-79
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  79-80
致谢  80-81

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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