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细胞表面展示—释放系统的构建及应用

作　者: 高文英
导　师: 张作明
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 细胞表面展示冰核蛋白蛋白内含子自剪切 CpCel5C
分类号: Q50
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

内切纤维素酶在纤维素酶系协同降解纤维素的过程中起到了关键作用。定向进化是获得高活力内切纤维素酶的重要途径。内切纤维酶定向进化的主要难点在于如何实现突变体酶与胞外不溶性天然底物的自由相互作用。基于上述认识,本论文在细胞表面展示系统基础上设计了一个新型的细胞表面展示-释放系统。以冰核蛋白(INP)作为载体蛋白,在INP与纤维素酶之间嵌入蛋白质内含子(intein),利用Intein的自剪切功能,将纤维素酶从细胞表面释放出来,以达到突变体酶自由与水不溶性纤维素相互作用的目的。以红色荧光蛋白为报告蛋白,研究了自动释放的条件,结果表明：在20mM Tris-HCl+0.9%NaCl, pH 7.9的裂解液中,37℃,放置48h的条件下,红色荧光蛋白从细胞表面释放,释放效率大约能达到50%,加入适量的还原剂,裂解效率会提高。在上述研究的基础上,根据Intein的剪切原理,进一步设计了细胞表面展示-可控释放系统,提高了载运容量,实现了可控释放的目的。具体的讲,我们将intein分成11aa的N端(IN)和144aa的C端,把IN连入前体蛋白,形成一个INP-IN-目的蛋白的三明治结构。需要N端发生裂解的时候,将IC加入反应体系,IC可以识别IN,催化IN的N末端发生N-S酰基转移,酯键被水解,从而完成N端裂解。以红色荧光蛋白为报告蛋白,优化了可控自动释放目的蛋白的条件,结果表明：在20mM pH 7.9 Tris-HCl+0.9%NaCl裂解液中,37℃下,加入intein的N端的互补片段C端和10mM DTT时,红色荧光蛋白从细胞表面释放效率达到30-40%。利用蛋白质工程技术克隆表达源于Clostridium phytofermentans的内切纤维素CpCe15C,并将此纤维酶构建到上述两个体系(pET20bp-INP-I-Ce15C和pET20b INP-IN-Ce15C)中,分别测定了细胞表面展示和释放功能,结果表明这两个细胞表面展示-释放系统都可以将目的内切纤维素酶释放到胞外,而且可以保持其原有的活力。本文设计构建了两个新型细胞表面展示-释放系统,将为纤维素酶的定向进化提供一个先进的研究平台。在生物学领域的的研究中也将会有很广阔的利用空间。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章绪论  11-23
  1.1 表面展示技术简介  11-14
    1.1.1 表面展示锚定单元简介  11-13
    1.1.2 细胞表面展示的应用  13-14
  1.2 蛋白内含子简介  14-21
    1.2.1 蛋白内含子的发现  15
    1.2.2 蛋白内含子的结构特征  15
    1.2.3 蛋白内含子的分类  15-16
    1.2.4 蛋白内含子的剪切机制  16-17
    1.2.5 蛋白内含子的剪接条件  17-18
    1.2.6 蛋白内含子的应用  18-21
  1.3 立题依据  21-23
第2章实验材料  23-29
  2.1 实验材料  23-29
    2.1.1 菌种和质粒  23-24
    2.1.2 培养基  24
    2.1.3 主要仪器  24-25
    2.1.4 主要试剂及配制方法  25-29
第3章细胞表面展示-释放系统的构建  29-44
  3.1 引言  29
  3.2 实验方法  29-34
    3.2.1 细胞表面展示载体的构建  29-31
    3.2.2 细胞表面展示-释放系统的构建  31-32
    3.2.3 红色荧光蛋白插入细胞表面展示-释放系统  32-33
    3.2.4 重组蛋白的表达  33-34
    3.2.5 细胞表面展示-释放系统释放条件的优化  34
  3.3 实验结果与讨论  34-43
    3.3.1 细胞表面展示-释放体系的构建  34-37
    3.3.2 重组体的表达  37-40
    3.3.3 细胞表面展示-释放系统释放条件的优化  40-43
  3.4 小结  43-44
第4章细胞表面展示-可控释放系统的构建  44-53
  4.1 引言  44
  4.2 实验方法  44-47
    4.2.1 细胞表面展示-可控释放系统的构建  44-45
    4.2.2 pET20b-IC的构建  45
    4.2.3 RFP插入细胞表面展示-可控释放系统  45-46
    4.2.4 表达  46
    4.2.5 优化细胞表面展示-可控释放系统的释放条件  46-47
  4.3 实验结果  47-52
    4.3.1 重组体的构建结果  47-49
    4.3.2 重组体的表达  49-50
    4.3.3 优化细胞表面展示-可控释放系统的释放条件  50-52
  4.4 小结  52-53
第5章细胞表面展示-释放系统在内切纤维素酶中的初步应用  53-61
  5.1 引言  53-54
  5.2 实验方法  54-57
    5.2.1 内切纤维素酶的构建  54
    5.2.2 内切纤维素酶连入细胞表面展示-释放系统  54
    5.2.3 重组体的表达  54
    5.2.4 粗酶液的制备  54-55
    5.2.5 粗酶液活力的测定  55-56
    5.2.6 验证内切纤维素酶连入细胞表面展示-释放系统  56-57
  5.3 实验结果  57-60
    5.3.1 内切纤维素酶的构建  57
    5.3.2 重组体的表达  57-58
    5.3.3 酶的活力测定  58-60
  5.4 小结  60-61
参考文献  61-66
致谢  66

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