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利用AcmA蛋白在乳酸乳球菌表面展示锰超氧化物歧化酶

作　者: 黄新凤
导　师: 李林
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 细胞表面展示系统乳酸乳球菌 AcmA Mn-SOD
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究分别利用乳酸乳球菌的自溶素AcmA及其C端锚定结构域cA-domain作为运载蛋白,通过在乳酸乳球菌ATCC11454菌株细胞表面展示来自大肠杆菌的锰超氧化岐化酶(Mn-SOD)蛋白而构建了具有全细胞催化活性的表面展示工程菌,并比较测定了两种运载蛋白对表面展示Mn-SOD活性的影响。首先,以革兰氏阳性菌(G~+)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为指示菌,通过抑菌筛选法从生牛奶中初筛得到具有抑菌活性的14株细菌菌株,然后通过个体形态与培养特征观测、部分生理生化反应、G+C mol%测定、16SrDNA序列比对分析、PCR扩增特异性N-乙酰胞壁酸水解酶基因acmA(该基因编码的蛋白参与乳酸乳球菌的细胞分离与自溶)与序列比对分析等鉴定,确定其中的一株具较高抑菌活性的分离株为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)菌株,命名为MB191。对多种G~+细菌、革兰氏阴性菌(G~-)细菌、酵母菌和丝状真菌的对峙培养抗性测定结果表明,MB191除对供试G~+细菌具有较高的抑菌活性以外,还对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)等G~-细菌和汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)等具有明显的抑菌活性。乳酸乳球菌的这一特性目前尚未见于文献报道。鉴于AcmA的cA-domain同样具有锚定细胞壁肽聚糖的功能,本研究以MB191的总DNA作为模板,PCR扩增得到乳酸乳球菌的自溶素基因acmA,分析AcmA的初级结构,通过SOE-PCR扩增得到含有AcmA信号和锚定结构域的融合基因asc。以大肠杆菌E.coli K-12的总DNA为模板,PCR扩增得到编码大肠杆菌超氧化物歧化酶的基因Mn-sodA,插入到大肠杆菌—乳酸乳球菌穿梭载体pMG36k上,构建了pMB192表达载体。然后分别将asc和acmA基因插入到pMB192的Mn-sodA基因直接上游,构建了pMB193(含asc/Mn-sodA)和pMB194(含acmA/Mn-sodA)的表面展示载体。将pMB192、pMB193和pMB194分别电转化到乳酸乳球菌ATCC11454,获得重组菌株MB192、MB193和MB194。重组菌株进行SDS-PAGE检测Mn-SOD及融合蛋白的表达。通过黄嘌呤氧化酶法测定全细胞Mn-SOD酶活力分别为1.53±0.38 U/mL、2.63±0.51U/mL和3.51±0.64 U/mL。MB194具有最大的表面展示效率,为56.4%。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
1 前言  11-30
  1.1 微生物细胞表面展示技术研究进展  11-17
    1.1.1 微生物细胞表面展示技术简介  11-12
    1.1.2 微生物表面展示系统的种类  12-15
      1.1.2.1 革兰氏阳性细菌表面展示系统  12
      1.1.2.2 革兰氏阴性细菌表面展示系统  12-14
      1.2.2.3 酵母表面展示系统  14-15
    1.1.3 微生物表面展示技术的应用现状  15-17
    1.1.4 细胞表面展示存在的问题及展望  17
  1.2 运载蛋白-AcmA  17-21
    1.2.1 肽聚糖锚定模体——LysM  17-19
    1.2.2 乳酸乳球菌自溶素蛋白-AcmA概述  19-20
    1.2.3 AcmA蛋白作为运载蛋白的表面展示应用  20-21
  1.3 乘客蛋白Mn-SodA蛋白  21-27
    1.3.1 SOD概述  21-22
    1.3.2 SOD种类  22-24
    1.3.3 SOD的提取制备及纯化  24-26
    1.3.4 SOD的活性测定  26
    1.3.5 SOD蛋白研究应用现状  26-27
  1.4 表面展示宿主菌——乳酸乳球菌  27-29
  1.5 研究目的和意义  29-30
2 材料与方法  30-42
  2.1 实验材料  30-35
    2.1.1 质粒  30-31
    2.1.2 菌株  31-32
    2.1.3 培养基  32-33
    2.1.4 PCR反应的引物  33-34
    2.1.5 试剂和仪器  34-35
      2.1.5.1 质粒和总DNA提取、质粒转化时所用到的试剂  34
      2.1.5.2 酶切、酶连、PCR和DNA回收所需试剂  34
      2.1.5.3 琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE电泳所需试剂  34-35
      2.1.5.4 仪器  35
  2.2 实验方法  35-42
    2.2.1 技术路线  35-36
    2.2.2 乳酸乳球菌分离鉴定  36-38
      2.2.2.1 抑菌活性菌株的分离  36-37
      2.2.2.2 分离菌株抑菌活性的测定  37
      2.2.2.3 分离菌株的形态观察与生理生化特征测定  37
      2.2.2.4 G+C mol%测定  37
      2.2.2.5 总DNA制备、PCR反应扩增16S rDNA与序列分析  37-38
      2.2.2.6 分离菌株acmA基因的PCR反应扩增与序列分析  38
    2.2.3 常规分子生物学操作  38-39
      2.2.3.1 大肠杆菌质粒的快速检测  38
      2.2.3.2 大肠杆菌质粒抽提  38
      2.2.3.3 酶连与大肠杆菌的CaCl_2法转化  38-39
      2.2.3.4 DNA电泳分析及回收  39
    2.2.4 乳酸乳球菌和大肠杆菌总DNA提取  39
    2.2.5 PCR扩增与DNA测序分析  39-40
    2.2.6 乳酸乳球菌感受态制备及电转化  40
    2.2.7 SDS-PAGE分析  40-41
      2.2.7.1 蛋白的样品制备  40-41
      2.2.7.2 SDS-PAGE凝胶的制备  41
      2.2.7.3 电泳、染色及脱色  41
    2.2.8 重组菌株SOD酶活测定  41-42
3 结果与分析  42-57
  3.1 乳酸乳球菌的分离与鉴定  42-46
    3.1.1 具抑菌活性菌株的初筛与活性比较测定  42
    3.1.2 分离菌株MB191的鉴定  42-46
      3.1.2.1 细菌形态与培养性状  42-43
      3.1.2.2 生理生化特性  43-44
      3.1.2.3 G+C mol%测定  44
      3.1.2.4 16S rDNA扩增、序列测定与聚类分析  44-45
      3.1.2.5 N-乙酰胞壁酸水解酶基因(acmA)的扩增与序列测定  45-46
  3.2 MB191的抑菌谱及其抑菌效果  46-48
  3.3 乳酸乳球菌表面展示载体的构建及Mn-SOD表达  48-57
    3.3.1 乳酸乳球表面展示载体的构建  48-54
      3.3.1.1 Mn-sod A基因PCR克隆及序列分析  48-49
      3.3.1.2 acmA与asc基因克隆与序列分析  49-51
      3.3.1.3 乳酸乳球菌重组质粒的构建  51-54
    3.3.2 Mn-SOD蛋白表达及酶活测定  54-57
      3.3.2.1 重组菌株鉴定  54-55
      3.3.2.2 重组菌株SDS-PAGE分析  55-56
      3.3.2.3 Mn-SOD酶活测定  56-57
4 讨论  57-60
  4.1 乳酸乳球菌的分离鉴定  57-58
  4.2 利用AcmA及cA-domain在乳酸乳球菌表面展示Mn-SOD  58-60
参考文献  60-73
致谢  73-74
附录  74-75

利用AcmA蛋白在乳酸乳球菌表面展示锰超氧化物歧化酶

内容摘要

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