学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究

作　者: 郭恒
导　师: 刘明远；徐德启
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 狂犬病病毒口服疫苗沙门氏菌破伤风毒素C片段冰核蛋白
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 52次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

狂犬病（Rabies）是由狂犬病毒（Rabies virus,RV）引起的可导致高致死率的危害严重的人兽共患病。我国人的狂犬病主要由患病犬咬伤或通过粘膜接触所致,对犬群的大规模免疫接种是控制狂犬病的最佳途径。目前我国使用的兽用狂犬病疫苗主要弱毒活疫苗及灭活细胞培养疫苗两种,前者在使用过程中存在毒力返祖的安全隐患,国际上对家养动物禁用狂犬病活疫苗;而后者主要依靠进口,供应量不足、价格昂贵,无法满足我国目前大规模免疫接种的需求。2010年我国农业部虽然批准首个灭活国产兽用狂犬病疫苗可以进行生产,但目前尚无价格低廉的产品上市。同时上述两种疫苗采用多次注射进行免疫,免疫程序繁冗,使用不便,限制在野生动物及犬群中的使用。沙门氏菌（Salmonella）血清型繁多,是人兽共患病原菌,其中鼠伤寒菌（Salmonella Typhimurium）对小鼠及犬类动物均易感。沙门氏菌为细胞内寄生菌,具有黏膜组织或抗原提呈细胞的亲嗜性,可经口服粘膜自然感染途径将重组基因直接呈送给抗原递呈细胞,有刺激抗原特异性体液和细胞免疫、诱导细胞凋亡的功能,含自身佐剂CpG基序,是最早用作活疫苗载体实验模型的工具菌之一,也是目前遗传背景最清楚、应用最广泛的活菌疫苗载体。减毒沙门氏菌携带异种抗原运送效率高、免疫方法简单、激发免疫应答全面,至今已介导40余种的病毒、细菌、寄生虫和与肿瘤治疗相关基因的表达。狂犬口服免疫具有简便、易行、群众易接受的特点,适合对犬群及野生动物的大规模免疫,口服免疫也是世界各国学者推崇的有效接种途径。狂犬病毒糖蛋白（glycoprotein,GP）是激发中和抗体的唯一有效抗原,而核蛋白（nucleoprotein,NP）可激发细胞免疫应答,促进中和抗体的产生。为此,本研究构建了以沙门氏菌为运载体携带狂犬病毒GP基因和NP基因的新型口服疫苗新型口服疫苗,进行了如下系列实验研究:1.为增强构建质粒的稳定性,PCR方法扩增pBR322克隆载体中rop基因调控片段定向插入pVAX1载体中,构建中低拷贝真核表达载体pR。Realtime PCR显示改造后的pR载体较pVAX1拷贝数降低约13倍。RT-PCR法扩增中国狂犬病毒人用疫苗株CTN-1的GP和NP基因,基因重组技术分别克隆至pVAX1载体中构建单基因表达载体pV-G和pV-N;重叠PCR法将破伤风毒素C片段（Tetanus Toxin Fragment C,TTc）与GP基因串联,两基因间设（G4S）2柔性linker,构建双基因串联融合表达载体pV-GT和pR-GTTc。构建的2个串联表达载体转染BHK-21细胞,间接免疫荧光及Western blot检测到融合蛋白的表达。2.构建的pV-G、pV-N、pV-GT、pR-GT真核表达质粒电转化入鼠伤寒沙门氏菌phoP/phoQ疫苗株（简称PQ）中,分别构建重组沙门氏菌PQ-VG、PQ-VN、PQ-VGT和PQ-RGT。重组菌体外无抗生素下连传100代,PQ-RGT中质粒滞留率较PQ-VGT高18%。于第1、3、14天以1x10¹⁰CFU剂量重组菌口服免疫11-13g雌性昆明鼠,末次免疫35天后发现PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组可抵抗12 LD50的CVS-24脑内致死性攻击,小鼠的保护率为65%,明显优于PQ-VG、PQ-VGT、PQ-RGT的单一细菌免疫组（保护率分别为25.0%、33.3%和43.8%）及PQ-VGT、PQ-VN混合免疫组（53.3%）。所有接种PQ的对照鼠CVS-24脑内攻击后3-14天内均出现典型狂犬病症状并最终死亡。3.为增强外源蛋白在沙门氏菌中表达的稳定性,以原核低拷贝克隆载体pGB2为基础进行构建重组表达载体。选取GP中含多个线性表位的179-281aa肽段（命名为Gepi）化学合成沙门氏菌偏嗜性密码子优化后的肽段Gopt。克隆丁香假单胞菌的冰核蛋白的N端截短区（INPn）和沙门氏菌PQ的体内厌氧诱导启动子PnirB及强转录终止子序列rrnbT1T2,根据特异酶切位点的粘性末端体外按PnirB、INPn、Gopt和rrnbT1T2顺序连接构建重组表达载体pGnirB-I-Gopt及未进行密码子优化的重组载体pGnirB-I-Gepi。重组质粒经电转化转入PQ中并分别命名为PQ-IGO和PQ-IG。菌落印迹和间接免疫荧光显示重组菌可经厌氧诱导肽段的表达,并可将其展示于细菌表面。重组菌PQ-IGO用于PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组的第3次的prime-boost,小鼠保护率为75.0%,略低于商品化疫苗腹腔注射prime-boost加强组,优于之前的非prime-boost免疫组及未进行密码子优化组。4.重组菌联合免疫激发的抗狂犬病毒中和抗体、抗破伤风毒素及沙门氏菌IgG,细胞因子IL2、INFγ以及Treg调节T细胞和CD4⁺CD8⁺T细胞含量等被检测,结果表明三种质粒联合应用可有效诱发针对狂犬、破伤风毒素及沙门氏菌的多价体液和细胞免疫应答,并可对75%以上的小鼠产生保护。本实验成功构建了以减毒伤寒菌为运载体的兼顾破伤风梭菌及鼠伤寒沙门氏菌免疫防治的多价狂犬病口服疫苗的实验模型。我国犬数量庞大,种群增殖快,并且交易频繁。由于目前狂犬病流行的自然宿主还不十分清楚,野生动物狂犬病疫情病原流行病学调查数据还不详实,新型口服狂犬病疫苗的研发将对深化我国狂犬病免疫防治现状具有重要意义。本课题以减毒伤寒菌为运载体,为安全有效的适合犬、猫及野生动物使用的新型暴露前预防性口服疫苗的研究奠定了基础。国内相关研究多为病毒活载体疫苗及基于反向遗传技术的弱毒活疫苗,本研究的成功可为狂犬口服疫苗的研制提供一种成本更加低廉的备选方案。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-12
英文缩写表  12-14
引言  14-16
第一篇文献综述  16-54
  第1章狂犬病毒和狂犬病  16-28
    1.1 病毒结构  16-17
    1.2 病原学特点  17-18
    1.3 流行病学  18-21
    1.4 发病机理  21
    1.5 狂犬病毒的生活史  21-25
    1.6 宿主细胞对狂犬病毒感染的应答  25-27
    1.7 结语  27-28
  第2章狂犬病疫苗的研究进展  28-44
    2.1 疫苗生产使用毒株简介  28-30
    2.2 人用疫苗发展概况  30-32
    2.3 兽用疫苗发展概况  32-34
    2.4 新型狂犬病实验室疫苗模型研究进展  34-43
    2.5 结语  43-44
  第3章沙门氏菌活载体疫苗研究进展  44-54
    3.1 基于沙门氏菌的疫苗诱发保护性免疫应答的方法  44-46
    3.2 沙门氏菌作为异源抗原的运载体研究进展  46-49
    3.3 沙门氏菌作为DNA 疫苗运载体研究进展  49-51
    3.4 沙门氏菌作为高级免疫调节单元研究进展  51-53
    3.5 结语  53-54
第二篇研究内容  54-98
  第1章狂犬CTN 株抗原基因的克隆及真核表达载体的构建  54-70
    1 材料  54-55
    2 方法  55-61
    3 结果  61-66
    4 讨论  66-68
    5 小结  68-70
  第2章重组沙门氏菌的构建及免疫组合方式的筛选  70-78
    1 材料  70-71
    2 方法  71-73
    3 结果  73-76
    4 讨论  76-77
    5. 小结  77-78
  第3章 GP 线性表位肽段表面展示载体的构建及效果评价  78-88
    1 材料  78
    2 方法  78-81
    3 结果  81-84
    4 讨论  84-87
    5 小结  87-88
  第4章异源PRIME-BOOST 免疫策略的评价  88-98
    1 材料  88
    2 方法  88-91
    3 结果  91-94
    4 讨论  94-96
    5 小结  96-98
结论  98-100
参考文献  100-114
攻读博士期间发表的学术论文及其它成果  114-116
致谢  116

利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究

内容摘要

全文目录

相似论文