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穿心莲内酯抗肿瘤作用及靶向NF-κB信号的分子机制研究

作　者: 龚萍
导　师: 王丽京；耿建国
学　校: 广东药学院
专　业: 病原生物学
关键词: 穿心莲内酯(Andrographolide) 核转录因子NF-κB 基因工程小鼠 小分子RNA干扰 胰腺瘤 黑色素瘤
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 77次
引　用: 1次
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内容摘要


穿心莲内酯( Andrographolide,Andro )是爵床科穿心莲属植物(Andrographis paniculata (Burm.f.)Nees)穿心莲提取物中的主要有效成分之一。作为天然植物药穿心莲在亚洲及南美一些国家用于炎症的治疗已经有上千年的历史,近来在对炎症的研究中,已有文献报道,Andro可以通过与NF-κB p50亚基的62位还原态半胱氨酸共价结合使其不能在细胞核内与DNA结合而起到阻抑NF-κB信号激活的作用。近年来的研究还表明,在多种肿瘤细胞中,NF-κB启动后,肿瘤相关因子如Bcl-Xl,c-FLIP,VEGF,MMP9等会高表达,使正常细胞的“凋亡的肿瘤监视功能”失调,并通过抗凋亡,促新生血管生成及促进浸润等过程而起到促进肿瘤发生发展的作用(17)。因此在肿瘤中NF-κB信号发挥着促进增殖、抑制凋亡而起着抗肿瘤的作用。而炎症与肿瘤有着密切的关系,那么Andro在炎症中是通过NF-κB起作用的,NF-κB又在肿瘤中起着重要的作用,那么Andro在肿瘤中的作用是否也与NF-κB信号有关呢?但Andro是否能够靶向NF-κB信号发挥抗肿瘤作用的研究目前尚未见报道。本课题采用基因工程小鼠(Rip1-tag2鼠)的自发胰腺瘤和B16黑色素皮下移植瘤为肿瘤研究模型,Andro腹腔治疗和已上市Andro滴丸的灌胃治疗为治疗方式,以及构建B16/p50siRNA稳定转染细胞株和B16/IκBα的稳定细胞株,检测细胞株的体内成瘤情况,研究Andro是否对肿瘤的生长和转移有抑制作用,以及Andro对肿瘤的抑制是否靶向NF-κB信号通路而发挥作用的。方法:1.Andro对肿瘤生长的作用建立Rip1-Tag2小鼠的胰岛β细胞瘤自发生长模型。Andro治疗(腹腔治疗5ug/g)为实验组,而无效对照药物4H-andro治疗(腹腔治疗5ug/g)为对照组通过计数血性胰岛、胰岛β细胞瘤数目,以及测量肿瘤的体积,探讨Andro在自发肿瘤中的作用。并用免疫组化技术检测肿瘤细胞中与肿瘤增殖、凋亡相关的标记性分子如Brdu、Tunel等,分析Andro对肿瘤增殖、凋亡的影响。采用C57小鼠,皮下接种B16黑色素瘤细胞,建立皮下移植瘤模型,用Andro治疗(腹腔治疗5ug/g)和对照药物4H-andro(腹腔治疗5ug/g)治疗,通过测量肿瘤体积和免疫组化技术检测肿瘤细胞中与肿瘤增殖、凋亡相关的标记性分子如Brdu、Tunel等,分析Andro对肿瘤增殖、凋亡的影响。2.Andro滴丸对肿瘤生长的作用采用C57小鼠,皮下接种B16黑色素瘤细胞,建立皮下移植瘤模型,用Andro滴丸治疗(灌胃治疗0.143ug/20g)和对照药物4H-andro(灌胃治疗0.143ug/20g)治疗,通过肿瘤体积、小鼠生存率、肿瘤重量,分析Andro滴丸对肿瘤发生发展的影响。3.Andro对肿瘤转移的作用给C57小鼠尾静脉注射B16黑色素瘤细胞,建立转移瘤模型,用Andro治疗(腹腔治疗5ug/g)和对照药物4H-andro(腹腔治疗5ug/g)治疗通过记录转移到肺的肿瘤结节数目,观察Andro对皮下移植瘤肺转移的作用。4.Andro对B16黑色素瘤细胞中NF-κB信号的作用利用B16黑色素瘤细胞系,构建B16/p50siRNA和B16/IκBα的稳转细胞株,分别用Andro(30umol)做为实验组,4H-andro(30umol)为对照组,检测细胞增殖的作用和观察不同细胞株在体内成瘤的的作用。结果:1、建立的Rip1-Tag2小鼠的胰岛β细胞瘤自发生长模型和皮下移植瘤模型,Andro治疗的小鼠的肿瘤体积和肿瘤数目明显小于4H-andro处理的。且免疫组化结果显示Andro处理的肿瘤组织细胞中Brdu增殖数目明显少于4H-andro处理的,同时凋亡细胞数明显增多。2、Andro滴丸处理的皮下植瘤模型结果显示Andro治疗的小鼠肿瘤体积和肿瘤重量明显小于4H-andro处理的,生存期也明显延长。3、皮下移植瘤肺转移瘤模型结果表明Andro治疗的小鼠转移到肺脏的肺表面结节数明显少于4H-andro处理的。4、Andro处理的B16/p50siRNA细胞株和B16/IκBα细胞株的增殖减少且细胞株的体内成瘤实验有明显抑制。结论:1、Andro抑制自发胰腺瘤和B16皮下移植瘤的生长,并能够抑制B16皮下移植瘤的肺转移。2、Andro抑制肿瘤可能是通过靶向NF-κB信号而发挥作用的。

全文目录


摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章 立题依据及研究思路  13-16
  1. 立题依据  13-14
  2. 研究思路  14-16
第二章 穿心莲内酯抗肿瘤作用的研究  16-38
  前言  16-17
  材料和方法  17-28
    1 材料  17-19
      1.1 动物  17
      1.2 细胞系  17
      1.3 主要试剂  17-18
      1.4 免疫组化相关主要试剂  18-19
      1.5 细胞培养主要试剂  19
    2. 方法  19-28
      2.1 细胞培养和生物学性状观察  19
      2.2 移植瘤模型建立  19
      2.3 肿瘤转移模型建立  19-20
      2.4 用药方式  20
      2.5 转基因动物  20-23
        2.5.1 转基因动物的饲养  20
        2.5.2 两种品系基因工程小鼠的杂交  20-21
        2.5.3 基因工程小鼠的鉴定与筛选  21-23
      2.6 胰腺组织处理  23-27
        2.6.1 肿瘤发生及生长进程的观察（分离胰岛，测量肿瘤体积）  23-24
        2.6.2 制作肿瘤组织石蜡切片  24-25
        2.6.3 HE 染色步骤  25-26
        2.6.4 免疫组化  26-27
        2.6.5 TUNEL  27
      2.7 图像分析方法（IPP）  27
      2.8 统计学分析  27-28
  实验结果  28-36
    1.A ndro 抑制了自发胰腺瘤 Rip1-ta92 的生长  28-30
      1.1 Andro 抑制了自发胰腺瘤的体积  28
      1.2 Andro 抑制了自发胰腺瘤的血性胰岛和肿瘤数目  28-29
      1.3 Andro 抑制了肿瘤细胞的增殖能力  29
      1.4 Andro 促进了肿瘤细胞的凋亡  29-30
    2.A ndro 抑制了皮下移植瘤  30-33
      2.1 Andro 对皮下移植瘤的预防治疗  30-31
      2.2 Andro 对皮下移植瘤的治疗  31
      2.3 Andro 抑制了皮下移植瘤细胞的增殖  31-32
      2.4 Andro 促进了皮下移植瘤细胞的凋亡  32
      2.5 Andro 抑制了皮下移植瘤的肺转移  32-33
    3.A ndro 滴丸抑制了皮下移植瘤  33-36
      3.1 Andro 滴丸对皮下黑色素瘤预防治疗  33-34
      3.2 Andro 滴丸对皮下移植瘤的治疗  34
      3.3 Andro 滴丸抑制了皮下肿瘤的重量  34-35
      3.4 Andro 滴丸延长了小鼠生存率  35-36
  讨论  36-38
第三章 穿心莲内酯靶向 NF-κB 信号的作用研究  38-56
  前言  38-39
  材料方法  39-47
    1. 材料  39
    2. 方法  39-47
      2.1 细胞培养  39
      2.2 细胞转染和荧光素酶报告基因实验  39
      2.3 电泳迁移改变实验（EMSA）  39-40
      2.4 稳定细胞株的构建  40-42
      2.5 细胞的保存和复苏  42
      2.6 MTT 实验  42-43
      2.7 Western Blot 的实验  43-47
  实验结果  47-54
    1. N F-κB 的报告基因检测  47
    2. 1 κBα质粒的构建和功能检测  47-48
    3. p 505iRNA 的质粒的功能检测  48-49
    4. 细胞株的构建  49-50
    5. 构建细胞株的 MTT 实验  50
    6. B16 细胞、B16/IκBα和 B16/p50siRNA 细胞株皮下成瘤实验  50-53
      6.1 皮下接种的细胞株的自然生长  50-51
      6.2 Andro 处理的细胞株肿瘤生长  51-52
      6.3 p50 siRNA 816 细胞株的Andro 处理  52
      6.4 IκBα过表达816 细胞株的Andro 处理  52-53
    7. A ndro 处理细胞株的 Western Blot 检测  53-54
  讨论  54-56
参考文献  56-61
全文小结  61-62
专业综述  62-71
缩略语词表  71-72
致谢  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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