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基因启动子甲基化与肺癌的相关性研究

作　者: 李慎
导　师: 颜真
学　校: 第四军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肺癌启动子甲基化焦磷酸测序 5-杂氮2-脱氧胞苷基因表达
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高、治疗效果相对较差的癌症。肺癌严重危害人类健康,已成为癌症死亡的首位病因。由于肺癌患者在出现症状首次就诊时,已有80 %因为出现转移或存在禁忌症而丧失手术机会。肺癌的总体5年生存率为15%,在我国低于10%。各期肺癌5年生存率:IA 67%、IB 57%、ⅡA 34%、ⅡB 24%、ⅢB 6%～8%、Ⅳ期为3%。因此,早期诊断肺癌对于提高5年生存率意义重大。DNA甲基化作为表观遗传学的一部分,可调控基因表达。已发现诸多基因启动子区域的甲基化异常与癌症相关,如细胞周期调控基因、DNA修复基因、血管形成基因、细胞凋亡相关基因、细胞黏附迁移相关基因、激素受体基因等。因此,甲基化正在成为一类新的生物标志物,成为肿瘤有效诊断的标志分子,也正在成为有希望的肿瘤治疗的候选靶标。实验研究显示去甲基化治疗,可以使因为异常高甲基化而表达沉默的p16等控制细胞增值、分化和凋亡的基因重新恢复表达,从而可能通过抑制肿瘤细胞生长、增加细胞间的黏附、恢复对化疗药的敏感性等,达到肿瘤治疗的目的。本课题拟通过检测肺癌相关基因启动子甲基化分析启动子甲基化与基因表达在肺癌细胞的生长、分化、增殖和凋亡中的关系研究,检测人外周血标本中肺癌相关基因启动子甲基化频率,探讨基因甲基化与肺癌发病的关系,评价甲基化标志作为肺癌早期诊断和作为治疗靶标的可行性。本课题选取NDRG2、P16、CDH1、RARbeta2及WIF-1五种候选抑癌基因,培养A549、GLC-82两种肺癌细胞,ECV-304、GES-1两种非肿瘤细胞作为对照,从细胞中提取基因组DNA,经过亚硫酸盐处理,使用PYRO ASSAY DESIGN设计的PCR引物进行目标基因启动子区域扩增,然后使用焦磷酸测序技术对基因甲基化程度进行分析。发现五种基因在四种细胞中都有不同程度的甲基化现象,其中NDRG2、P16、RARbeta2基因的甲基化频率在肺癌细胞组与非肿瘤细胞组之间有明显差异,而CDH1与WIF-1两种基因无显著差异。为探讨基因启动子区域甲基化状态与基因表达之间的关系,我们采用甲基化转移酶抑制剂5-杂氮2-脱氧胞苷(5-Aza-2-CdR)对两种肺癌细胞进行不同浓度和时间的处理,发现处理后NDRG2、P16、RARbeta2三种基因恢复表达,提示这三种基因在肺腺癌细胞中的表达沉默与启动子高甲基化相关。目前大部分甲基化基因与癌症相关性的研究都是基于临床活检的,基于体液(血浆/血清、痰、尿、腹水等)的甲基化分析很少。本实验对肺癌病人及正常人外周血提取的基因组DNA中五种基因启动子区域的甲基化程度进行了分析,其中NDRG2、P16、CDH1三个基因肺癌组的甲基化频率高于正常组,并具有统计学意义,与文献的结果一致。而WIF-1基因肺癌组的甲基化频率虽然略高于正常组,但两组间并无统计学差异,不排除检测样本量小、检测位点不特异以及不同检测方法带来的偏差。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
文献回顾  14-25
正文  25-49
  实验一体外培养细胞中肺癌相关基因启动子甲基化状态分析  25-35
    1 材料  25-27
    2 方法  27-30
    3 结果  30-33
    4 讨论  33-35
  实验二启动子甲基化与基因表达的关联性研究  35-42
    1 材料  35-36
    2 方法  36-38
    3 结果  38-40
    4 讨论  40-42
  实验三肺癌患者外周血液标本中肺癌相关基因启动子甲基化与疾病相关性研究  42-49
    1 材料  43-44
    2 方法  44
    3 结果  44-46
    4 讨论  46-49
小结  49-50
参考文献  50-58
个人简历和研究成果  58-59
致谢  59

基因启动子甲基化与肺癌的相关性研究

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