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寡肽转运蛋白PepT2的表达及阿魏酸药物分子的修饰

作　者: 薛永亮
导　师: 卢奎；赵东欣
学　校: 河南工业大学
专　业: 应用化学
关键词: 寡肽转运蛋白 PepT2 转运机制阿魏酸
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 38次
引　用: 1次
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内容摘要

PepT（PepT1:SLC15A1或PepT2:SLC15A2）能够转运大部分的二肽和三肽,其转运主要是依赖H+与非耗能性Na+/H+泵转运系统逆浓度进行的,有利于小肽的吸收。PepT2是一种高亲和力、低容量的转运载体。它在人体中分布广泛,不仅能转运二、三肽,也可以识别和转运许多仿肽类药物,如β-内酰胺抗生素、血管紧张素转换酶抑制剂、贝他定等。PepT2的转运机制不同于氨基酸的吸收机制,底物的仿肽结构特征影响其转运速率。本论文利用Blast（NCBI）等生物学软件,分析了寡肽转运蛋白PepT2的基因序列。根据PepT2的基因序列及载体pET30a（+）的图谱设计引物,PCR扩增目的基因,并构建了pET30a（+）-PepT2重组质粒,将重组质粒转化到表达载体E.coli BL21（DE3）pLysS中。测序发现经PCR扩增的PepT2 DNA有三个碱基发生突变（672位的A突变为T,966位的A突变为T,1918的G突变为A）,其中一个碱基的突变造成所翻译的氨基酸发生突变（G640S）。之后,对含有pET30a（+）-PepT2重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达,但是由于PepT2基因中的稀有密码子含量高达11%,使得寡肽转运蛋白在大肠杆菌中表达困难,结果没能检测到寡肽转运蛋白。利用液相合成法合成了乙酰阿魏酰苯丙氨酸甲酯、乙酰阿魏酰酪氨酸甲酯;利用固相合成法合成了乙酰阿魏酰酪氨酸、乙酰阿魏酰酪氨酰酪氨酸（F-Tyr-Tyr）四种阿魏酸衍生物,并对合成产物进行了结构表征。利用紫外光谱法、荧光光谱法研究了阿魏酸和F-Tyr-Tyr与DNA的相互作用。分别考察了阿魏酸和F-Tyr-Tyr的浓度、作用时间及温度对相互作用的影响。结果表明,当阿魏酸与DNA相互作用后体系的紫外吸收光谱成减色效应,推测二者之间相互作用模式主要是静电结合;随着阿魏酸浓度的增加,EB-DNA体系的荧光猝灭,猝灭常数为1.015×10³ L·（mol·s）^-1,根据Stern-Volmer方程可判断为静态猝灭。当F-Tyr-Tyr与DNA相互作用后体系的紫外吸收光谱成减色效应,推测二者之间相互作用模式主要是静电结合;随着F-Tyr-Tyr浓度的增加,EB-DNA体系的荧光猝灭,猝灭常数为6.28×103 L·（mol·s）^-1,根据Stern-Volmer方程可判断为静态猝灭。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章引言  11-22
  1.1 寡肽转运蛋白（PepT2）  11-19
    1.1.1 PepT2 的分布、结构功能和转运机制  11-14
      1.1.1.1 PepT2 的分布  11-12
      1.1.1.2 PepT2 的结构与功能  12-13
      1.1.1.3 PepT2 的转运机制  13-14
    1.1.2 PepT2 与药物的相互作用  14-17
      1.1.2.1 PepT2 与抗生素的相互作用  15
      1.1.2.2 PepT2 与表皮生长因子的相互作用  15-16
      1.1.2.3 PepT2 与甲状腺抑制剂的相互作用  16
      1.1.2.4 PepT2 与降血糖及降血压药物的相互作用  16-17
      1.1.2.5 PepT2 与抗肿瘤及抗癌药物的相互作用  17
      1.1.2.6 PepT2 与其他药物的相互作用  17
    1.1.3 PepT2 转运底物的结构特征  17-18
    1.1.4 PepT2 的研究前景  18-19
  1.2 阿魏酸及其衍生物  19-20
    1.2.1 阿魏酸  19-20
    1.2.2 阿魏酸的修饰  20
  1.3 本课题的选题意义及主要内容  20-22
第二章寡肽转运蛋白(PepT2)的表达  22-36
  2.1 实验材料  22-23
    2.1.1 主要仪器设备  22-23
    2.1.2 数据库及分析软件  23
    2.1.3 试剂  23
    2.1.4 实验菌种  23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 寡肽转运蛋白(PepT2)基因的扩增  23-24
      2.2.1.1 寡肽转运蛋白PepT2 基因序列引物设计  23-24
      2.2.1.2 PepT2 目的基因的PCR 扩增  24
    2.2.2 质粒载体的制备  24-25
    2.2.3 重组质粒的构建  25-26
      2.2.3.1 pMD18-T-PepT2 重组克隆质粒的构建  25
      2.2.3.2 PCR 目的产物和质粒的酶切  25
      2.2.3.3 目的基因和质粒的连接  25-26
    2.2.4 重组质粒转化 E.coli DH5α菌株  26
      2.2.4.1 CaCl_2 法制备感受态细胞  26
      2.2.4.2 质粒的转化  26
    2.2.5 pET30a(+)-PepT2 重组质粒的检测及鉴定  26-27
      2.2.5.1 重组质粒的检验  26-27
      2.2.5.2 重组质粒的PCR 鉴定  27
      2.2.5.3 重组质粒的酶切鉴定  27
      2.2.5.4 重组质粒的测序鉴定  27
    2.2.6 寡肽转运蛋白PepT2 的诱导表达  27-28
      2.2.6.1 表达菌株的转化  27
      2.2.6.2 重组质粒的诱导表达  27-28
  2.3 结果与讨论  28-34
    2.3.1 目的基因的PCR  28
    2.3.2 pMD18-T-PepT2 重组质粒的构建  28-29
    2.3.3 pMD18-T-PepT2 重组克隆质粒的PCR 鉴定和酶切鉴定  29-30
    2.3.4 pET30a-PepT2 重组表达质粒的构建  30-31
    2.3.5 pET30a-PepT2 重组表达质粒的PCR 鉴定和酶切鉴定  31-32
    2.3.6 目的基因分析  32-33
    2.3.7 PepT2 的诱导表达  33-34
  2.4 本章小结  34-36
第三章阿魏酸酰胺类化合物的合成及其性质研究  36-61
  3.1 实验材料与方法  36-42
    3.1.1 实验材料  36-37
    3.1.2 实验方法  37-42
      3.1.2.1 乙酰阿魏酸(E-3-(4’-乙酰基-3’-甲氧苯基)-2-丙烯酸)的合成[61]  37
      3.1.2.2 四种氨基酸甲酯盐酸盐的合成  37-38
      3.1.2.3 两种乙酰阿魏酰氨基酸甲酯的合成  38-39
      3.1.2.4 乙酰阿魏酰酪氨酸和乙酰阿魏酰酪氨酰酪氨酸的合成  39-40
      3.1.2.5 阿魏酸修饰物与小牛胸腺肽DNA 的相互作用  40-42
  3.2 结果与讨论  42-59
    3.2.1 乙酰阿魏酸  42
    3.2.2 四种氨基酸甲酯盐酸盐  42-44
    3.2.3 乙酰阿魏酰氨基酸甲酯  44-48
    3.2.4 乙酰阿魏酰酪氨酸和乙酰阿魏酰酪氨酰酪氨酸  48-50
      3.2.4.1 乙酰阿魏酰酪氨酰酪氨酸  48-49
      3.2.4.2 乙酰阿魏酰酪氨酸  49-50
    3.2.5 阿魏酸修饰物与小牛胸腺肽DNA 的相互作用  50-59
      3.2.5.1 紫外光谱法研究阿魏酸与DNA 的相互作用  51-53
      3.2.5.2 荧光光谱法研究阿魏酸与DNA 的相互作用  53-55
      3.2.5.3 紫外光谱法研究乙酰阿魏酰酪氨酰酪氨酸与DNA 的相互作用  55-57
      3.2.5.4 荧光光谱法研究乙酰阿魏酰酪氨酰酪氨酸与DNA 的相互作用  57-59
  3.3 本章小结  59-61
结论  61-62
参考文献  62-67
附录  67-71
致谢  71-72
个人简历  72

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