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纳米氧化锌颗粒诱导BEAS-2B细胞IL-8基因表达的机制

作　者: 徐磊
导　师: 吴逸明；吴卫东
学　校: 郑州大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 纳米氧化锌颗粒人支气管上皮细胞白细胞介素-8 NFκB C/EBPβ mRNA 稳定性
分类号: TB383.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

[研究背景]纳米颗粒是尺寸小于100 nm的人造颗粒物,具有广泛的用途。纳米金属氧化物(如纳米氧化锌)是目前世界上纳米产量吨位较高的纳米材料。纳米氧化锌颗粒(Zinc Oxide nanoparticles, ZnO-NPs)可通过呼吸道、皮肤、消化道等途径进入人体。志愿者吸入实验研究结果表明,ZnO-NPs可引起“金属烟雾热”；支气管灌洗液中炎症细胞介素水平如白细胞介素8(Interleukin 8, IL-8)以及中性粒细胞数目均较对照组明显升高。体外研究结果显示,ZnO-NPs可刺激人呼吸道上皮细胞产生过量的IL-8。呼吸道IL-8主要来源于上皮细胞,在介导外源性毒物所致各种肺脏疾病过程中起关键作用。目前,ZnO-NPs所致IL-8基因表达的机制尚不清楚。[研究目的]阐明国产ZnO-NPs(30 nm)对人支气管上皮细胞IL-8基因表达的影响；揭示纳米氧化锌颗粒诱导IL-8基因表达的分子生物学机制。[研究方法]以人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)为体外模型。用MTT方法测定ZnO-NPs对细胞的损伤作用。用RT-PCR和ELISA方法分别测定ZnO-NPs对IL-8mRNA和蛋白表达水平的影响。使用转录抑制剂和表达突变IL-8基因促进子的BEAS-2B细胞株观察ZnO-NPs对IL-8基因转录的影响。利用IL-8 mRNA降解试验测定ZnO-NPs对转录后IL-8 mRNA稳定性的影响。利用胞噬作用抑制剂观察细胞吞噬作用在ZnO-NPs所致IL-8表达过程中的作用。此外,利用原子吸收光谱手段测定ZnO-NPs在培养液中的溶解水平。[研究结果]ZnO-NPs刺激可致细胞内IL-8 mRNA水平及培养液上清中IL-8蛋白含量明显升高,该作用呈时间(2 h-4 h)及剂量(1μg/cm2-4μg/cm2)依赖性(P=0.000)。用转录抑制剂放线菌素D (1μg/ml)预处理细胞30 min,可显著降低ZnO-NPs (4μg/cm2,2 h)对IL-8 mRNA表达的诱导作用(P=0.000),表明ZnO-NPs在转录水平调控IL-8基因表达。利用可表达野生型、NFκ,B和C/EBPβ结合位点突变型IL-8促进子的BEAS-2B细胞株,观察到在表达突变IL-8促进子细胞内,ZnO-NPs (4μg/cm2,2 h)对IL-8转录活性的影响较在野生型细胞明显降低(P=0.000),说明转录因子NFκB和C/EBPβ参与调节纳米氧化锌对IL-8基因转录的诱导过程。在用放线菌素D终止IL-8 mRNA合成的前提下,ZnO-NPs(4μg/m2)可明显减缓细胞内IL-8 mRNA的降解,表现为在不同作用时间点(1h,2h,4h), ZnO-NPs处理组IL-8 mRNA水平均较相应对照组(无ZnO-NPs刺激)高(P值分别为0.021、0.002、0.001),说明ZnO-NPs对IL-8 mRNA有稳定作用。用细胞松弛素B(10μg/ml)预处理细胞30 min,可明显降低ZnO-NPs(4μg／cm2,2 h)对IL-8 mRNA表达的诱导作用(抑制率为30.14%)(P=0.000),提示部分ZnO-NPs可通过胞噬作用进入细胞进而诱导IL-8的表达。8μg/ml(相当于24孔培养板一孔内加入4μg/cm2 ZnO-NPs) ZnO-NPs在培养液中37℃温育2 h,有4.3%的ZnO-NPs溶解,培养液上清中锌离子的浓度为3.57μM。[结论]ZnO-NPs刺激可明显提高人支气管上皮细胞内IL-8 mRNA和蛋白的表达水平；转录因子NFKB和C/EBPβ在ZnO-NPs所致IL-8基因转录过程中起重要调节作用；ZnO-NPs对细胞内IL-8 mRNA具有稳定作用；部分ZnO-NPs可通过胞噬过程进入细胞诱导IL-8基因的表达。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
1 引言  10-13
2 材料与方法  13-24
  2.1 实验材料  13-16
  2.2 人支气管上皮细胞株及其培养  16-17
  2.3 技术路线与实验方法  17-24
3 结果  24-37
  3.1 ZnO-NPs对BEAS-2B细胞的损伤作用  24
  3.2 ZnO-NPs刺激可增加BEAS-2BIL-8mRNA和蛋白表达水平  24-25
  3.3 ZnO-NPs对BEAS-2B细胞内IL-8基因转录的影响  25-28
  3.4 ZnO-NPs对IL-8 mRNA稳定性的影响  28-30
  3.5 细胞吞噬作用对ZnO-NPs诱导IL-8表达的影响  30-31
  3.6 ZnO-NPs在培养液中溶解水平  31-32
  3.7 不同RT-PCR实验的扩增曲线和溶解曲线  32-37
4 讨论  37-42
5 结论  42-43
展望  43-44
参考文献  44-49
综述  49-67
  参考文献  59-67
个人简历  67-68
致谢  68

纳米氧化锌颗粒诱导BEAS-2B细胞IL-8基因表达的机制

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