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为提高牛附红细胞体病血清学诊断的特异性和灵敏性,本试验探索一种准确高效的牛附红细胞体特异性抗原制备技术,同时建立双抗体夹心ELISA诊断方法,以检测牛附红细胞体病,并探讨其临床应用的可行性。采集红细胞感染率>90%的牛附红细胞体阳性抗凝血,应用常规方法制备附红细胞体悬液,采用反复冻融-超声波裂解法将附红细胞体悬液裂解破碎制得粗制抗原蛋白液,用其免疫家兔,制备兔抗牛附红细胞体阳性血清。用所制的的抗原蛋白进行SDS-PAGE试验,分离胶浓度为11%,浓缩胶浓度为5%。经1.5h电泳、1h染色、1h脱色后,观察牛附红细胞体全抗原蛋白组分,选择4条染色较深的抗原蛋白进行切胶纯化：粗制抗原经SDS-PAGE方法电泳后,蛋白带于pH 13.0,4mol/LNaAc溶液中染成棕褐色,切下被选的4条目的蛋白带,放于蒸馏水中,摇床上振摇脱色后,分别装于透析袋中进行水平电泳,然后用PBS溶液4℃透析过夜,用聚乙二醇(PEG-6000)浓缩后,沉淀后取上清液,应用SDS-PAGE检验纯化结果。再应用免疫印迹技术(Western-blotting),经转印电泳、免疫染色后,通过观察硝酸纤维素膜上显影的蛋白条带颜色确定有免疫原性的抗原蛋白成分。利用切胶纯化技术收集有免疫原性的抗原蛋白成分,按常规方法免疫家兔,获取免疫血清,用辛酸硫酸铵法提取纯化IgG,应用过碘酸钠改良法标记IgG。利用粗制抗原蛋白液、纯化的IgG和辣根过氧化物酶标记的IgG进行双抗体夹心ELISA试验,探索抗体最佳包被量、酶标抗体最适工作浓度、和抗原最低检出量,并进行特异性试验、交叉性试验、重复性试验和扩大性试验,以建立特异灵敏的双抗体夹心ELISA诊断方法。牛附红细胞体抗原全蛋白经SDS-PAGE试验后,有4条抗原蛋白带显色较深。应用切胶技术分离此4条蛋白条带(条带1、条带2、条带3和条带4),经分析分子量分别为114.9kDa,70.1kDa,60.6 kDa,49.4 kDa,免疫印迹试验表明,条带1、2、3为阳性,且条带2中只有部分成分与抗体反应,而条带4为阴性。双抗体夹心ELISA试验结果表明,抗体最佳包被量为78.1μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1：400,抗原最低检出量为4.71μg/mL,敏感度提高。特异性阻断试验结果显示,兔抗牛附红细胞体阳性血清可阻断阳性抗原的显色反应,而阴性血清不能阻断；由交叉性试验结果可见只有附红细胞体产生阳性反应,而弓形虫、血孢子虫、大肠杆菌呈阴性,证明了该方法具有良好特异性。应用建立的方法初步对某三个奶牛场100份奶牛血样进行检测,阳性检出率为52.0%,与镜检法(41.0%)相比,检出率提高。试验结果证明本试验提供的制备牛附红细胞体特异性抗原的技术方法完全可行,所建立的双抗体夹心ELISA诊断方法是一种特异、灵敏、快速的诊断方法,对临床诊断意义重大。
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