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中华鳖暴发性败血症的研究

作　者: 胡广洲
导　师: 李登峰
学　校: 宁波大学
专　业: 水产养殖
关键词: 中华鳖败血症球状病毒病理鸡胚培养测序细菌
分类号: S947.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

对中华鳖(Trionyx sinensis)暴发性败血症进行了研究,该病是2005年来发生于浙江宁波等地区中华鳖生态养殖场的一种暴发性疾病,病鳖主要的症状为出血性败血,死亡严重。对中华鳖暴发性败血症流行情况,主要组织病理变化和超微病理变化进行了研究,确定了该病病原,并对病原进行了研究。流行病学调查表明,中华鳖暴发性败血症主要流行浙江宁波等地区的中华鳖生态养殖场,病鳖主要为体重150-200 g的幼鳖,成、亲鳖也有患病感染。发病季节为6-10月份,其中6-9月份为发病高峰期,发病池塘10天内累积死亡率可达90-100%,主要的症状为出血性败血,常规药物进行治疗无效,给养殖生产带来很大经济损失。对病鳖组织涂片,镜检观察未发现寄生虫。病鳖组织通过电镜检测病原,观察可见病鳖心、肝、肠及胃等组织内存在大量90-100 nm的球状病毒颗粒,未发现气单胞菌等的感染,且从病鳖组织中分离纯化到了大小、形态相同的病毒颗粒。用病鳖组织匀浆液和组织匀浆滤液对健康鳖进行回归感染,都可引起鳖死亡,死亡的中华鳖解剖观察结果与之前患病中华鳖症状基本一致,其中组织匀浆液攻毒组中华鳖死亡率比组织匀浆滤液组高15%。上述结果表明病毒是原发性病原,细菌加重病情。组织病理研究结果表明,患病中华鳖肝脏、肠、胃均表现出非常明显的病理学变化。肝脏、肠、胃等组织细胞肿胀充血,排列松散,并可见破坏的血细胞,呈败血症状,胃、心等组织细胞出现空泡化,心脏中血细胞减少,肾小球失血萎缩,还有部分肾小球坏死解体、消失,肾小管破裂,脾髓中部分血细胞破裂。超微病理研究结果表明,患病中华鳖的肝脏组织细胞病变最为严重,在各组织细胞中均观察到了球状病毒颗粒。从各组织细胞的病理变化来看,主要表现为线粒体减少,嵴断裂,甚至呈空泡化,溶酶体增多,细胞发生坏死、凋亡。使用SPF鸡胚对败血症病毒进行培养研究,采用卵黄囊接种法和羊膜腔接种法接种鸡胚,36℃培养。收获接种后第2-7天死亡的鸡胚,7天内不死的鸡胚第8天停止培养。对鸡胚的培养时间进行方差分析可知,实验组和对照组的鸡胚培养时间差异极显著(p<0.01),两种方法接种的鸡胚培养时间无显著性差异(p>0.05);在实验组鸡胚的卵黄囊膜中经电镜观察可见大量病毒,和病鳖组织中的病毒大小、形态基本相同;将实验组鸡胚制成攻毒液对中华鳖进行回归感染成功,死亡的中华鳖症状与该病例基本相同;并采用卵黄囊接种法对病毒进行两次传代培养,结果实验组和对照组的鸡胚培养时间差异均极显著(p<0.01)。上述结果表明鸡胚培养中华鳖球状病毒成功,卵黄囊膜接种法和羊膜腔接种法接种效果基本相同,病毒能够在鸡胚中传代培养。对病毒的理化特性进行研究,结果表明病毒对热(56℃)、酸(pH 3.0)和碱(pH 11.0)表现不稳定;对脂溶剂(氯仿)敏感;紫外线照射30 min可使大部分病毒灭活。对病毒进行了初步纯化,提取病毒DNA,采用6条随机引物,对病毒的核酸进行了扩增和测序初步研究,除两条引物没有扩增和测序成功外,共测得4条基因序列,Blastn结果表明,4条序列与Genebank中的序列同源性或覆盖率不高。4条序列中仅有1条氨基酸序列可以通读,Blastp结果表明该序列和甲基化酶家族基因同源。测序结果结合电镜观察结果,说明所测病毒应该是一种新病毒。从病鳖体内分离到8株细菌,对细菌进行形态观察,结合16S rDNA序列分析鉴定8株细菌分别为为格氏乳球菌、假单胞菌、海氏肠球菌、屎肠球菌、人苍白杆菌、惰性嗜血杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和迟钝爱德华氏菌。对格氏乳球菌、弗氏柠檬酸杆菌和迟钝爱德华氏菌进行药敏试验发现,格氏乳球菌对青霉素等4种药物敏感,弗氏柠檬酸杆菌对头孢唑啉等13种药物敏感,迟钝爱德华氏菌对新霉素等3种药物敏感,药敏结果可对该病的治疗起到帮助。采用16S rDNA分析方法,构建了病鳖体表和体内细菌克隆文库。结果表明,中华鳖体表和体内文库克隆子分别归为15和11类OTU,体表和体内菌群多样性较强,优势细菌类群分别为拟杆菌类群和变形菌类群,并在文库中检测到了几株益生菌和条件致病菌。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章绪论  12-22
  1.1 中华鳖分类地位及养殖概况  12
  1.2 中华鳖疾病研究进展  12-21
    1.2.1 病毒性疾病  13-14
    1.2.2 细菌性疾病  14-17
    1.2.3 真菌性疾病  17-18
    1.2.4 寄生虫疾病  18-19
    1.2.5 非生物性疾病  19-20
    1.2.6 小结  20-21
  1.3 本研究的目的及意义  21-22
第二章中华鳖暴发性败血症流行情况及病原的确定  22-28
  2.1 实验材料  22
    2.1.1 实验用鳖  22
    2.1.2 试剂与仪器设备  22
  2.2 实验方法  22-23
    2.2.1 病鳖症状观察与初步镜检  22
    2.2.2 流行情况  22
    2.2.3 电镜观察检测病原  22
    2.2.4 病毒感染试验  22-23
    2.2.5 病毒纯化  23
  2.3 结果  23-26
    2.3.1 病鳖症状观察与初步镜检  23-24
    2.3.2 流行情况  24
    2.3.3 病原电镜观察结果  24-25
    2.3.4 病毒感染试验结果  25-26
    2.3.5 纯化病毒负染结果  26
  2.4 讨论  26-28
第三章中华鳖暴发性败血症的病理研究  28-33
  3.1 中华鳖暴发性败血症的组织病理研究  28-31
    3.1.1 实验材料  28-29
    3.1.2 实验方法  29
    3.1.3 实验结果  29-30
    3.1.4 讨论  30-31
  3.2 中华鳖暴发性败血症的超微病理研究  31-33
    3.2.1 实验材料  31
    3.2.2 实验方法  31
    3.2.3 实验结果  31-32
    3.2.4 讨论  32-33
第四章中华鳖球形病毒的研究  33-53
  4.1 中华鳖球形病毒的鸡胚培养研究  33-42
    4.1.1 实验材料  33
    4.1.2 实验方法  33-35
    4.1.3 结果  35-41
    4.1.4 讨论  41-42
  4.2 病毒理化特性的研究  42-44
    4.2.1 实验材料  42
    4.2.2 实验方法  42-43
    4.2.3 结果  43-44
    4.2.4 讨论  44
  4.3 随机引物扩增病毒核酸、测序的初步研究  44-53
    4.3.1 实验材料  44-45
    4.3.2 实验方法  45-46
    4.3.3 实验结果  46-51
    4.3.4 讨论  51-53
第五章患暴发性败血症中华鳖体内外细菌研究  53-73
  5.1 体内细菌的分离培养  53-63
    5.1.1 实验材料  53
    5.1.2 方法  53-55
    5.1.3 实验结果  55-61
    5.1.4 讨论  61-63
  5.2 体内外细菌的菌群分析  63-73
    5.2.1 实验材料  63-64
    5.2.2 实验方法  64-65
    5.2.3 实验结果  65-71
    5.2.4 讨论  71-73
第六章本研究的主要结论与研究展望  73-76
  6.1 主要结论  73-74
    6.1.1 流行情况调查  73
    6.1.2 病原的确定  73
    6.1.3 致病机理的探讨  73
    6.1.4 中华鳖球状病毒的研究  73-74
    6.1.5 患病中华鳖体内外细菌分析  74
  6.2 论文创新点  74
  6.3 研究展望  74-76
    6.3.1 对该病的流行病学进行更加深入、系统的研究  74-75
    6.3.2 对病毒的生物学特性进行深入研究  75
    6.3.3 加强免疫防治研究  75-76
参考文献  76-83
附录英文缩写对照表  83-84
附录图版说明  84-91
在学研究成果  91-92
致谢  92

中华鳖暴发性败血症的研究

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