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刺参养殖池塘有机物降解微生物的分离筛选及其特性研究

作　者: 闫法军
导　师: 田相利
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 参池降解微生物富集驯化分离筛选降解特性
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

刺参(Apostichopus japonicus Selenka)养殖业是一新兴海水养殖产业,主要分布在大连和山东沿海。自2002年以来,刺参养殖业发展迅速,2006年全国刺参养殖面积已达到8.4万公顷,产量达到7.6万吨,产值接近100亿元,成为我国海水养殖的重要的特色支柱产业。然而,相对于其迅速发展的养殖规模,与刺参养殖技术相关的基础研究还相对滞后。由于刺参养殖生产带有很大的随意性和经验性,导致刺参养殖相继出现了一系列问题,制约了该产业的健康发展。其中,刺参池塘养殖过程中人工补充投饵所致残饵积累及其对池塘和近海造成的潜在的影响已日益受到人们的关注。有益微生物在改善和修复水产养殖环境、提高养殖动物生长速度和增强病害抵抗力方面的应用已非常多,并得到了人们的广泛认可。因此,从刺参养殖池塘土著微生物中筛选有益微生物,并利用其对刺参养殖池塘污染环境进行调控,改善并修复养殖水体环境,保持刺参健康生长以及促进该产业的可持续发展具有十分重要的理论和实践意义。本研究通过采集刺参养殖池塘中底泥、水体和刺参肠道微生物样品,分别对其中的常温和低温饵料降解菌以及常温和低温芽孢杆菌降解菌四种菌群进行了富集驯化和分离筛选,同时,对筛选出的降解效果好的菌株进行了降解特性及优化组合研究。主要研究结果总结如下：1.刺参养殖池塘有机污染物降解菌的富集驯化与分离筛选本研究在常温(28±1℃)和低温(15±1℃)两个温度下分别对刺参养殖池塘中的常温饵料降解菌和低温饵料降解菌进行了富集驯化和分离筛选。根据细菌对刺参饵料中的有机物、氨氮、淀粉和蛋白四种成分的降解利用效果进行了筛选,最后筛选到5株常温饵料降解菌(CR1、CR5、CR18、CR19、CR24)和7株低温饵料降解菌(DR3、DR4、DR7、DR8、DR11、DR12、DR13)。研究结果表明,不同菌株对刺参饵料中各个成分的降解利用效果有所差异。常温菌中,菌株CR1和CR24对COD和蛋白的利用效果以最好,5d时分别达到了41.0%～44.5%和44.3%～54.5%的去除率,淀粉的利用效果以CR18和CR19的最佳,5d的去除率达49.4%-57.2%；低温菌中,COD的降解效果以DR7和DR8的最好,5d的去除率达37.7%-50.0%,氨氮的利用效果以DR7、DR8和DR11最佳,5d去除率达95.0%～99.8%。各菌株对淀粉和蛋白有一定程度的降解,但利用率普遍不高。根据菌株形态特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,将CR1初步鉴定为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus), CR5归属为葡萄球菌属细菌(Staphylococcus sp.), CR18归属为芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.), CR19和CR24两菌初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);将DR3、DR7、DR11、DR12、DR13五株归属为假单胞菌属细菌(Pseudomonas spp.), DR4归属为放线菌属细菌(Plantibacter sp.), DR8归属为副球菌属细菌(Paracoccus sp.)。2.刺参养殖池塘有益芽孢杆菌的富集驯化与分离筛选在常温(28±1℃)和低温(15±1℃)两个温度下分别对刺参养殖池塘中对有机污染物具有较好降解效果的常温芽孢杆菌降解菌和低温芽孢杆菌进行了富集驯化和分离筛选。根据细菌对刺参饵料中的有机物、氨氮、淀粉和蛋白质等4种成分的降解利用效果进行筛选,最后筛选到5株常温芽孢杆菌(Y11、Y20、Y22、Y24、Y26)和4株低温芽孢杆菌降解菌(YD11、YD13、YD19、YD20)。研究结果表明,不同菌株对刺参饵料中各个成分的降解利用效果有所差异。在常温芽孢杆菌中,Y20、Y24和Y26对COD的的降解效果最好，5d时达到了32.9%-42.3%的去除率；蛋白和淀粉的利用效果普遍较好,以Y22和Y26的最佳,5d的去除率分别达34.4%～49.1%、66.9%-68.7%；各菌株对氨氮利用普遍不佳,相对而言,菌株Y24和Y26有一定的氨氮控制和去除效果；在低温芽孢杆菌中,菌株YD11对COD和氨氮的降解效果最好,5d的去除率分别达50.0%、98.0%；而YD13、YD19、YD20对蛋白和淀粉的降解效果好，5d的去除率分别为29.8%-63.9%、40.6%～53.2%。根据菌株形态特征、生理生化特性以及16Sr DNA序列分析,菌株Yll、Y20归属为芽孢杆菌属细菌(Bacillus spp.), Y22初步鉴定为腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus), Y24初步鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),Y26初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens), YD11、YD13、YD19、YD20四株细菌归属为芽孢杆菌属细菌(Bacillus spp.)o3.几株有机污染物降解菌株特性研究本研究以菌株对刺参饵料中的有机物和氨氮两种成分的降解利用效果为依据,对刺参养殖池塘中筛选的3株对有机污染物降解效果较好的低温饵料降解菌(DR7、DR8和DR11)的特性进行了比较研究。研究结果表明,3菌株对饵料中有机物和氨氮都有很好的降解去除作用,降解动态过程显著,其中以DR8的降解性能最佳,该菌株以刺参饵料为唯一营养源,低温(15℃)、低接种量(<5‰)条件下能同时高效降解饵料中的有机物和氨态氮,5d期间对富集培养基中COD和NH4-N的最高降解率分别达54.4%和99%。进一步研究表明,菌株DR8生长适温15-30℃,生长适宜pH7-10,降解刺参饵料中COD和NH4-N的最适温度条件为15-20℃、最适pH条件为8.0～8.5；在最适降解条件下、接种量为5‰时,对10-20g/L高质量浓度的刺参饵料液中COD降解效果显著,3d时间去除率达56.9%～65.7%,对1-20g/L质量浓度的刺参饵料液中NH4-N 3d时间的去除率达91.7%-99.9%。根据形态特征、生理生化特性以及基于16S rDNA序列分析,菌株DR7和DR11归属于假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.), DR8归属为马氏副球菌(Paracoccus marcusii)。4.几株有益菌株优化组合及其降解效果研究本研究以菌株对刺参饵料中的有机物和氨氮两种成分的降解利用效果为依据,对刺参养殖池塘中所筛选出的效果较好的有机污染物降解菌进行了优化组合及降解效果研究。研究结果表明,与最佳对照单菌株比较,各组合菌对饵料COD和氨氮的降解效果有所差异。通过比较,常温饵料降解菌以CR5-CR19组合为最佳,5d的COD和氨氮去除率分别为45.0%、70.3%；低温饵料降解菌以DR4-DR7-DR11最佳组合,5d的COD和氨氮去除率分别为49.4%、98.4%；DR7-DR11组合对氨氮降解效果亦较佳,去除率达到96.7%。常温芽孢杆菌中,以组合Y11-Y26对有机物和氨氮降解效果最佳,能同时有效利用饵料中有机物和氨氮,而Y11-Y24组合对有机物降解效果最佳,5d的COD去除率为44.0%,显著优于对照单菌株；低温芽孢杆菌中,有机物降解最佳组合为YD11-YD13-YD19,5d的COD去除率为75.9%,氨氮降解最佳组合为YD11-YD20,5d的氨氮去除率达到了91.6%。

全文目录

摘要  5-9
Abstract  9-16
0 前言  16-17
1 文献综述降解微生物在水产养殖中的应用及研究进展  17-28
  1.1 水产养殖污染概况  18
  1.2 降解微生物与水产养殖  18-23
    1.2.1 降解微生物的种类  19
    1.2.2 降解微生物生物修复机制  19-20
    1.2.3 降解微生物在水产养殖中的应用研究  20-22
    1.2.4 刺参养殖存在问题  22-23
  1.3 本研究目的  23
  参考文献  23-28
2 刺参养殖池塘有机污染物降解菌的富集驯化与分离筛选  28-50
  2.1 材料与方法  30-34
    2.1.1 培养基  30-31
    2.1.2 样品采集与处理  31
    2.1.3 菌株的富集、驯化与分离  31-32
    2.1.4 菌株筛选  32
    2.1.5 细菌利用刺参饵料的能力  32-33
    2.1.6 细菌鉴定  33
    2.1.7 分析方法  33-34
  2.2 结果  34-46
    2.2.1 常温饵料降解菌的分离筛选  34-39
    2.2.2 低温饵料降解菌的分离筛选  39-46
  2.3 讨论  46-48
    2.3.1 降解菌的富集驯化和分离筛选  46-47
    2.3.2 降解菌的饵料降解能力  47-48
  参考文献  48-50
3 刺参养殖池塘有益芽袍杆菌的富集驯化与分离筛选  50-71
  3.1 材料与方法  52-55
    3.1.1 培养基  52
    3.1.2 样品采集与处理  52-53
    3.1.3 菌株的富集、驯化与分离  53
    3.1.4 菌株筛选  53-54
    3.1.5 细菌利用刺参饵料的能力  54
    3.1.6 细菌鉴定  54-55
    3.1.7 分析方法  55
  3.2 结果  55-66
    3.2.1 常温芽孢杆菌降解菌的分离筛选  55-61
    3.2.2 低温芽孢杆菌降解菌的分离筛选  61-66
  3.3 讨论  66-69
    3.3.1 芽孢杆菌的富集驯化和分离筛选  66-67
    3.3.2 芽孢杆菌的饵料降解能力  67-69
  参考文献  69-71
4 几株有机污染物降解菌株特性研究  71-90
  4.1 材料与方法  72-75
    4.1.1 实验菌株  73
    4.1.2 培养基  73
    4.1.3 菌株鉴定  73
    4.1.4 三菌株降解特性比较研究  73-74
    4.1.5 最优菌株DR8降解特性研究  74-75
    4.1.6 分析方法  75
  4.2 结果  75-86
    4.2.1 菌株鉴定  75-76
    4.2.2 三菌株饵料降解特性比较研究  76-79
    4.2.3 最优菌株DR8降解特性研究  79-86
  4.3 讨论  86-88
  参考文献  88-90
5 几株有益菌株优化组合及其降解效果研究  90-104
  5.1 材料与方法  91-93
    5.1.1 实验菌株  91-92
    5.1.2 培养基  92
    5.1.3 菌株间拮抗研究  92
    5.1.4 菌株优化组合效果测定  92
    5.1.5 数据分析方法  92-93
  5.2 结果  93-100
    5.2.1 常温饵料降解菌优化组合研究  93-94
    5.2.2 低温饵料降解菌优化组合研究  94-96
    5.2.3 常温芽孢杆菌降解菌优化组合研究  96-98
    5.2.4 低温芽孢杆菌降解菌优化组合研究  98-100
  5.3 讨论  100-102
  参考文献  102-104
6 附录  104-118
7 致谢  118
8 个人简历  118
发表的学术论文  118

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