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临床假丝酵母菌药敏分析及耐药基因ERG11突变研究

作　者: 应颖
导　师: 徐方云；黄孝天
学　校: 南昌大学
专　业: 病理生理学
关键词: 假丝酵母菌氟康唑药物敏感性白假丝酵母菌 ERG11基因耐药性
分类号: R379
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

第一部分假丝酵母菌的分离、鉴定与药敏分析目的:对引起假丝酵母菌感染的临床菌株进行分离鉴定,研究江西省假丝酵母菌临床分离株的流行病学特点,并监测其对氟康唑药物的耐药性,为合理使用抗生素提供依据。方法:对2005-2008年收集的2681株假丝酵母菌临床分离株,采用CHROMagar显色培养基、Vitek2 YST鉴定条和假丝酵母菌基因快速诊断-多重PCR鉴定法进行菌株鉴定,并按照美国国家临床试验标准化研究所(CLSI)推荐的《酵母菌的液基稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案第二版》(M27-A2)方案测定2681株假丝酵母菌对氟康唑药物的敏感性。结果:2005-2008年共收集假丝酵母菌2681株,其中,白假丝酵母菌1903株,占71.0%;光滑假丝酵母菌486株,占18.1%;热带假丝酵母菌142株,占5.3%;克柔假丝酵母菌99株,占3.7%;其他菌种为51株,占1.9%。其中,1690(63.0%)株来源于痰液,623 (23.2%)株来自阴道,169(6.3%)株分离自尿液,102(3.8%)株来自大便,44(1.6%)株分离于血液,10(0.4%)株分离于腹水,其余43(1.6%)株来源其他部位。白假丝酵母菌在痰、阴道、大便、腹水、尿液和血液中所占的比例分别为:76.1%、68.2%、63.7%、60%、47.3%和31.8%;光滑假丝酵母菌在痰、阴道、大便、腹水、尿液和血液中所占的比例分别为:14.7%、19.7%、22.5%、40.0%、34.9%和40.9%;热带假丝酵母菌在尿液中所占的比例为12.4%,而在痰、阴道、大便、血液中所占的比例不到7.0%。2681株假丝酵母菌中,氟康唑耐药株为226株,耐药率为8.4%;氟康唑剂量依赖敏感株109株,占4.1%;敏感株2346株,敏感率为87.4%。白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌的氟康唑耐药率分别为4.5% (86/1903)、6.4% (31/468)、7.0% (10/142)和100% (99/99)。不同部位的假丝酵母菌的氟康唑耐药率也有所不同,其中来自阴道部位的假丝酵母菌氟康唑耐药率最高,为13.5% (84);其次为大便9.8% (10),尿液8.3% (14),其他部位7.0% (3),血液6.8% (3)和痰液6.6%(112)。结论:1、白假丝酵母菌仍然为临床上最为常见和最主要的致病菌,其次为光滑假丝酵母菌。2、白假丝酵母菌主要常见于呼吸道、阴道和肠道的感染,而光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌主要见于无菌部位(血液和尿道)的感染。现今假丝酵母菌的临床感染谱已发生变化,其中非白假丝酵母菌引起的感染日趋增加,已成为血液和尿道真菌感染的主要原因。3、假丝酵母菌江西临床分离株对氟康唑总体耐药率不高,血液与痰来源的假丝酵母菌对氟康唑的敏感性高,但是感染阴道部位的假丝酵母菌对氟康唑耐药率高,达13.5%。4、氟康唑依然是一个有效的抗真菌药物,但对克柔假丝酵母菌和阴道假丝酵母菌的感染应谨慎选择合适的抗真菌药物。第二部分白假丝酵母菌耐药基因ERG11突变分析目的:检测白假丝酵母菌临床分离株氟康唑靶酶编码基因(ERG11)突变,探讨其与耐药性的关系。方法:以2005-2008年收集的白假丝酵母菌临床分离株72株(氟康唑耐药菌株49株,氟康唑剂量依赖敏感(S-DD)株16株和敏感菌株7株)为研究对象,PCR扩增白假丝酵母菌ERG11全基因序列,DNA测序后经生物信息学比对及分析ERG11基因的突变。结果:经DNA测序分析后,72株白假丝酵母菌ERG11基因序列中共发现27个无义突变和14个错义突变,其中: (1) D225H、K342R、G450E和V488I这四个错义突变仅见于氟康唑耐药菌株;(2) G129A仅见氟康唑剂量依赖敏感株中;(3) Y132H、A114S、Y257H、V437I、G465S、G448E和K128T这七个突变同时出现于耐药株及剂量依赖敏感株中。此外发现在65株氟康唑耐药株和剂量依赖敏感株中存在7种多位点错义突变模式:(1) D116E、K128T、Y132H和G465S同时出现在2株耐药株和3株S-DD株中;(2) A114S和Y257H同时出现在11株氟康唑耐药株和3株S-DD株中,但不伴有其他位点的同义突变;(3) Y132H和G450E同时出现在2株氟康唑耐药菌株中,但不伴有其他位点的同义突变;(4) Y132H和G448E同时出现在3株菌株中但不伴有其他位点的同义突变;(5) E266D和V488I同时出现在3株耐药株中;(6)D116E、E266D和V488I同时出现在2株耐药菌株中;(7)D116E、E266D和V437I同时出现在2株耐药菌株和1株S-DD株中。另外,我们也发现单突变模式比如V437I和K342R也存在于耐药菌株中。结论:1.白假丝酵母菌敏感菌株和耐药菌株ERG11基因的突变各不相同,多位点错义突变模式和单位点错义突变是导致耐药的分子基础,多位点错义突变是剂量依赖敏感株和耐药株中ERG11基因突变的主要形式,也可能是导致耐药的主要机制之一。2.首次报导D116E、K128T、Y132H和G465S,D116E、E266D和V437I及D116E、E266D和V488I等多位点错义突变模式。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-15
第1章引言  15-24
  参考文献  21-24
第2章假丝酵母菌的分离、鉴定与氟康唑药敏分析  24-44
  第1节材料与方法  25-32
    1.1 材料  25-27
      1.1.1 标本来源与质控菌株  25
      1.1.2 主要仪器设备  25-26
      1.1.3 主要试剂  26
      1.1.4 主要的溶液成分和试剂的配制  26-27
    1.2 方法  27-32
      1.2.1 临床菌株的培养  27-28
      1.2.2 临床菌株的鉴定  28-30
      1.2.3 微量稀释药敏试验  30-32
  第2节结果  32-38
    2.1 假丝酵母菌基因诊断  32
    2.2 标本来源和菌株分布  32-34
      2.2.1 假丝酵母菌的菌种的分布  32-33
      2.2.2 假丝酵母菌的来源分布情况  33-34
      2.2.3 假丝酵母菌的菌种及来源分布情况  34
    2.3 氟康唑体外药敏结果  34-38
      2.3.1 假丝酵母菌氟康唑药敏分析  34-35
      2.3.2 不同来源部位氟康唑药敏分析  35
      2.3.3 不同来源部位的各种假丝酵母菌氟康唑药敏分析  35-38
  第3节讨论  38-41
  第4节结论  41-42
  参考文献  42-44
第3章耐氟康唑白假丝酵母菌ERG11 基因突变分析  44-61
  第1节材料与方法  45-48
    1.1 材料  45
      1.1.1 实验菌株  45
      1.1.2 主要仪器设备  45
      1.1.3 主要试剂  45
      1.1.4 主要试剂配制方法  45
    1.2 方法  45-48
      1.2.1 菌株的复活和真菌的增菌培养  45-46
      1.2.2 白假丝酵母菌基因组DNA 的提取  46
      1.2.3 白假丝酵母菌ERG11 基因的扩增  46-47
      1.2.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳  47
      1.2.5 PCR 产物分析、测序及DNA 序列分析  47-48
  第2节结果  48-52
    2.1 ERG11 基因PCR 扩增结果  48
    2.2 ERG11 基因DNA 序列分析  48-52
  第3节讨论  52-58
  第4节结论  58-59
  参考文献  59-61
致谢  61-62
附录 A 测序峰图  62-64
攻读学位期间的研究成果  64-65
附带综述  65-71

临床假丝酵母菌药敏分析及耐药基因ERG11突变研究

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