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目的：随着医学的发展,严重威胁儿童的急性感染性疾病的发病率与死亡率已大幅下降,而恶性肿瘤已成为威胁儿童生命的主要疾病之一,其中血液肿瘤占绝大多数,且发病率有逐年增高之势。由于病因不明确,早期发现、对因治疗受到限制,目前已成为儿童的主要杀手。化疗仍是其治疗的主要手段,近年来由于化疗方案的不断改进,长期生存率也有所升高,但仍有部分患儿不能缓解或复发。因而探索病因、寻求一种更为有效的防治措施对改善患儿的预后和生活质量具有十分重要的意义。DNA甲基化是表观遗传修饰的重要组成部分,甲基化修饰异常在血液肿瘤发生、发展中扮演重要角色。特异基因的异常甲基化可作为血液肿瘤的分子标志物,在临床用于观察疗效及治疗靶标。ZO-1(zonula occludens)基因所表达的是一种紧密连接蛋白,是膜相关鸟苷酸激酶家族成员之一,是维持细胞结构完整和正常极性的必需蛋白,在细胞连接及信号传导中起重要作用,参与调控细胞的增殖与分化。近年有学者应用RLGS技术首次在鼠白血病细胞中发现ZO-1基因启动子区呈现高甲基化状态,导致该基因表达受抑,提示ZO-1可能是一个白血病相关基因。但目前国内外尚无该基因在儿童血液肿瘤中的相关研究报道。本实验通过检测血液肿瘤患儿骨髓ZO-1基因甲基化情况,以探讨其在儿童血液肿瘤发生、发展中的作用,旨在寻找新的儿童血液肿瘤分子标志物，为临床提供早期诊断、疗效判定、预后分析、微小残留病检测及靶向治疗的理论和实验依据。方法：将确诊为白血病[急性淋巴细胞性白血病(ALL),急性髓细胞性白血病(AML),慢性粒细胞性白血病(CML)]、淋巴瘤[霍奇金病(HD),非霍奇金淋巴瘤(NHL)]及神经母细胞瘤患儿治疗前、化疗前期、化疗中期、化疗后期、临床缓解以及复发病例的骨髓标本作为研究组,非血液肿瘤患儿骨髓作为对照组。采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)方法,分别检测研究组与对照组患儿骨髓中ZO-1基因的甲基化状态,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测研究组与对照组ZO-1基因mRNA的表达情况,同时用ZO-1基因经MS-PCR扩增后的甲基化条带进行凝胶成像系统荧光强度半定量分析的荧光强度积分值(IOD值),观察研究组化疗过程中IOD的动态变化,并与外周血白细胞数及骨髓中恶性肿瘤细胞数进行相关性分析。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。所有计量数据采用均数±标准差((?)±S)表示并进行t检验,连续观察数据采用重复测量方差分析,计数资料用卡方检验或Fisher s确切概率法,两因素之间的相关性采用直线相关分析。P<0.05有统计学意义。结果：1研究组与对照组比较：两组年龄、性别均无显著性差异(P>0.05)。2 MS-PCR检测结果：研究组治疗前共52例,有47例出现ZO-1基因甲基化条带,阳性率为90.4%(47/52例),对照组共20例,无一例出现,两组比较,差异具有显著性(P<0.001)。其中淋巴瘤患儿为92.6%(25/27例),[NHL为95.2%(20/21例),HD为83.3%(5/6例)]；白血病为86.7%(13/15例),[ALL为100%(5/5例),AML为75%(6/8例),CML为100%(2/2例)]；神经母细胞瘤为90%(9/10例)。各疾病及同一疾病不同分型间阳性率均无显著性差异(P>0.05)。动态观察研究组39例(化疗过程中有11例放弃治疗,2例死亡,即共有39例可进行化疗连续观察),治疗前甲基化阳性率为92.3%(36/39例),化疗前期为84.6%(33/39例),化疗中期为76.9%(30/39例),化疗后期为69.2%(27/39例),临床缓解13例,有5例仍可检出,为38.5%(5/13例)。治疗前与化疗前期、中期比较均无显著性差异(P>0.05),与化疗后期比较差异具有显著性(P<0.05)。随着化疗的进展,患儿骨髓逐步缓解,可以见到完全甲基化条带减少,出现过渡性的部分甲基化条带到消失。化疗过程中有2例复发,ZO-1基因甲基化由部分甲基化条带转变为完全甲基化条带。动态观察研究组39例中,淋巴瘤21例,治疗前ZO-1基因甲基化20例,阳性率95.2%(20/21例),化疗前期17例,阳性率80.95%(17/21例),化疗中期16例,阳性率76.2%(16/21例),化疗后期14例,阳性率66.7%(14/21例),临床缓解9例,有2例检出,阳性率为22.2%(2/9例)。治疗前与化疗前、中期比较差异均无显著性(P>0.05),与化疗后期比较,差异具有显著性(P<0.05)。有1例NHL患儿复发,甲基化状态由部分甲基化转变为完全甲基化；白血病11例,治疗前ZO-1基因甲基化10例,阳性率90.9%(10/11例),化疗前期10例,阳性率90.9%(10/11例),化疗中期9例,阳性率81.8%(9/11例),化疗后期8例,阳性率72.7%(8/11例),临床缓解3例,有2例检出,阳性率66.7%(2/3例)。治疗前与化疗前、中、后期比较差异均无显著性(P>0.05)。有1例急性早幼粒细胞白血病患儿复发,甲基化状态由部分甲基化转变为完全甲基化；神经母细胞瘤7例,治疗前ZO-1基因甲基化6例,阳性率85.7%(6/7例),化疗前期6例,阳性率85.7%(6/7例),化疗中期5例,阳性率71.4%(5/7例),化疗后期5例,阳性率71.4%(5/7例),临床缓解1例,仍可检出,阳性率100%(1/1例)。治疗前与化疗前、中、后期甲基化比较差异均无显著性(P>0.05)。达到临床缓解的ZO-1基因甲基化检出以神经母细胞瘤和白血病较高。3 RT-PCR检测结果：研究组治疗前52例提取总RNA,有5例见到ZO-1基因表达,阳性率为9.6%(5/52例)；对照组均有表达。两组比较具有显著性差异(P<0.001),表明研究组治疗前ZO-1基因表达沉默。动态观察研究组39例ZO-1基因表达阳性率治疗前为7.7%(3/39例),化疗前期为15.4%(6/39例),化疗中期为23.1%(9/39例),化疗后期为30.8%(12/39例),临床缓解13例,8例有ZO-1基因表达,阳性率为61.5%(8/13例)。治疗前与化疗前期、中期比较差异均无显著性(P>0.05),与化疗后期比较差异具有显著性(P<0.05)。4 IOD值检测结果：研究组动态观察治疗前39例IOD值均数为20,715.87±10,854.81799,化疗前期为12,183.64±7,093.12756,化疗中期为9,703.744±6,938.87355,化疗后期为5,669.667±4,761.52117,化疗前、中、后期分别与治疗前比较,均具有显著性差异(P<0.05),化疗前、中、后期之间进行比较,差异亦具有显著性(P<0.001)。说明经过化疗后,ZO-1基因甲基化程度有所下降。5研究组治疗前IOD值相关性分析：52例中男、女性别IOD值比较无显著性差异(P>0.05)。年龄与IOD值无直线相关关系(P>0.05)。外周血白细胞总数与IOD值无直线相关关系(P>0.05)。骨髓中恶性肿瘤细胞数与IOD值呈直线相关关系(P<0.001),且呈正相关。说明甲基化程度与性别、年龄、外周血白细胞数无关,与恶性肿瘤细胞数密切相关。结论：1 ZO-1基因在儿童血液肿瘤中呈特异性高甲基化状态,无论在淋巴瘤、白血病、神经母细胞瘤中均可检测到,与儿童血液肿瘤发生、发展及转归密切相关,是预后不良因素之一。2 ZO-1基因高甲基化状态导致基因表达沉默,ZO-1基因有可能起到抑癌基因的作用。3 ZO-1基因甲基化状态与性别、年龄、外周血白细胞数无关,、与骨髓恶性肿瘤细胞数有关。4随着化疗的进行,ZO-1基因甲基化状态在治疗前后具有明显变化,甲基化程度逐渐下降,临床缓解的患儿仍有部分可检测出,因此有可能成为新的分子标志,为临床提供早期诊断、疗效判定、预后分析、微小残留病检测的指标。
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