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低强度脉冲超声波对牙周膜细胞成骨分化影响的初步研究

作　者: 周洁
导　师: 宋锦璘
学　校: 重庆医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 低强度脉冲超声牙周膜细胞成骨分化碱性磷酸酶骨钙素核心结合因子即早基因整合素β1
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 43次
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内容摘要

hPDLCs是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞,包含成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞及未分化间充质细胞等多种细胞成分;它可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞并形成牙槽骨、牙骨质及牙周膜,是牙周组织再生的细胞学基础,尤其对于牙周病治疗具有极其重要的研究价值。牙周病治疗终极目的是牙周组织再生和形成新附着。促进牙周组织再生的关键之一是牙槽骨新生,即诱导hPDLCs成骨分化并行使功能。在牙周病损区域中,hPDLCs数量和功能活性都是有限的。如何促进该区域牙周膜细胞增殖及骨向分化对牙周病组织修复具有不可估量的研究价值。近年来,LIPUS因其具有缩短骨折愈合时间、增加骨密度、改善力学特性,促使软骨骨化成熟等生物作用而被作为一种无创、安全、有效的治疗方法广泛用于骨折延迟愈合和骨不连等疾病治疗。大量研究证实LIPUS作为一种机械信号,具备以下组织作用机制: 1.促进组织中具有增殖分化潜能的前体细胞增殖及成骨分化;2.增强功能细胞生物活性;3.改善血液循环。因此,本研究首次将LIPUS引入诱导hPDLCs成骨分化以促进牙周组织再生治疗的研究具有重要意义。目的:1.建立hPDLCs的LIPUS体外辐照模型,为下一步研究LIPUS对hPDLCs成骨分化影响提供实验基础。2.通过连续动态观察LIPUS对hPDLCs合成分泌碱性磷酸酶、骨钙素的影响,探讨LIPUS是否具有hPDLCs骨向诱导分化能力并遴选适宜参数。3、以多个具有重要生理功能并可能在力学转导过程中处于调控枢纽地位的分子为切入点,研究LIPUS对hPDLCs integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1mRNA表达的影响,为揭示LIPUS对hPDLCs成骨分化调控机制提供一些实验依据。方法:1、采用组织块法原代培养hPDLCs并传代建立有限细胞系,进行形态学观察、细胞组织学来源鉴定、绘制细胞生长曲线,为下一步LIPUS辐照提供实验细胞。2、采用第4代hPDLCs消化后接种于6孔板中,LIPUS辐照参数为:工作频率1.5MHz;脉冲重复频率1.0KHz;脉冲占空比1:4,幅宽:200us;按输出强度90mW/cm2、60mW/cm2、30mW/cm2;同一声强辐照时间为10min,20min,30min分组,连续作用5天后检测各组ALP活性并遴选适宜的辐照参数用于后续试验。3、采用第5代hPDLCs,按90mW/cm2-20min/d连续辐照15天,分别于5、7、9、11、13、15天时间点,采用生化法和放射免疫法检测碱性磷酸酶和骨钙素合成分泌情况。4、取第5代hPDLCs,以90mW/cm2-20min/d LIPUS辐照处理5d,镜下见细胞汇合约90%,收集需要检测的细胞,采用RT-PCR检测integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1的mRNA表达情况。结果:1、本实验培养的hPDLCs细胞形态、生长曲线均与文献报道相近,免疫组化证实所培养细胞来源于中胚层,结合取材部位说明本实验培养细胞为牙周膜细胞,可用于本实验研究2、经LIPUS辐照后,各组ALP活性均有不同程度提高,其中90mW/cm2-20min/d组改变最为明显。3、LIPUS连续辐照15天研究发现,细胞裂解液中的ALP于第5天开始增加,第11天达峰值,第13天下降较明显;分泌至上清液中的ALP于第9天开始增加,第11天达峰值,第13天时开始下降。同时,上清液中骨钙素于第9天显著增加,第15天达峰值。4、以90mW/cm2-20min/d LIPUS辐照处理5d,引起integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1mRNA表达不同程度上调。结论:1、LIPUS对hPDLCs骨向分化具有促进作用,本实验条件下较适宜作用参数为90mW/cm2-20min/d2、LIPUS(90mW/cm2-20min/d)连续作用15d,牙周膜细胞ALP合成于第5天开始增加,第9天开始ALP向胞外分泌增加,第11天时合成及分泌同时达峰值,于第13天时均有下降。骨钙素作为成骨分化晚期标志蛋白,分泌于第9天显著增加,第15天达峰值,LIPUS诱导合成高峰稍晚于碱性磷酸酶。3、LIPUS辐照下integrinβ1、c-fos、c-jun、cbfa1表达均有上调,提示上述基因可能参与了LIPUS诱导hPDLCs骨向分化的调控过程。推测其可能机制为:LIPUS以机械应力信号为主要形式作用于hPDLCs上,首先影响“细胞外基质-整合素-细胞骨架”力学信号转导系统,通过MAPK信号通路将物理信号传入核内,诱导即早基因c-fos、c-jun和成骨控制基因cbfa1转录翻译增加,可能进一步形成AP-1或与cbfa1相互调节影响成骨相关基因的表达,如碱性磷酸酶、骨钙素表达增加并发挥其生物学效应,从而实现LIPUS对hPDLCs的成骨分化诱导。

全文目录

英汉缩略词表  7-9
中文摘要  9-13
ABSTRACT  13-15
前言  15-24
第一部分人牙周膜细胞体外培养和低强度脉冲超声辐照模型构建  24-32
  1 材料和方法  24-27
    1.1 主要材料与设备  24-25
    1.2 hPDLCs 原代培养及传代  25
    1.3 细胞来源鉴定  25-26
    1.4 hPDLCs 生长曲线和倍增时间  26
    1.5 hPDLCs 低强度脉冲超声辐照模型建立  26-27
  2 结果  27-29
    2.1 细胞生长情况观察  27-28
    2.2 细胞来源鉴定  28
    2.3 细胞生长曲线  28
    2.4 LIPUS 辐照模型的建立  28-29
  3 讨论  29-31
    3.1 人牙周膜细胞组织取材方法的选择  29-30
    3.2 hPDLCs 原代培养方法的选择  30
    3.3 遴选实验对象hPDLCs  30-31
    3.4 “LIPUS-hPDLC 辐照模型”构建  31
  4 小结  31-32
第二部分LIPUS 对HPDLCS 成骨分化能力的影响  32-40
  1 材料和方法  33-35
    1.1 主要材料与设备  33
    1.2 方法  33-35
      1.2.1 实验设计分组方案  33-34
      1.2.2 细胞接种及超声辐照处理  34
      1.2.3 碱性磷酸酶（ALP）活性检测  34
      1.2.4 放射免疫法测定骨钙素（OC）  34-35
    1.3 统计学分析  35
  2 结果  35-37
    2.1 不同LIPUS 辐照参数对hPDLCs ALP 活性影响  35-36
    2.2 LIPUS 辐照对hPDLCs ALP 活性影响的动态观察  36-37
    2.3 LIPUS 辐照对hPDLCs 骨钙素合成分泌的影响  37
  3 讨论  37-39
  4 小结  39-40
第三部分 HPDLCS 对LIPUS 的早期响应  40-53
  1 材料和方法  41-45
    1.1 主要材料与设备  41-42
    1.2 方法  42-45
      1.2.1 细胞处理及样品收集  42
      1.2.2 RT-PCR 检测  42-45
  2 结果  45-47
    2.1 提取RNA 质量鉴定  45-46
    2.2 RT-PCR 结果  46-47
  3 讨论  47-52
    3.1 Integrin 与细胞应力响应机制  47-50
    3.2 AP-1 与细胞信号转导  50-51
    3.3 Cbfa1 与成骨分化  51-52
  4 小结  52-53
全文总结  53-55
参考文献  55-62
附图  62-67
综述低强度脉冲超声波细胞作用机制的研究进展  67-81
致谢  81-82
攻读学位期间发表论文情况  82

低强度脉冲超声波对牙周膜细胞成骨分化影响的初步研究

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