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番茄溃疡病furA和katA基因突变体的构建

作　者: 安春香
导　师: 李春奇；程红梅
学　校: 河南农业大学
专　业: 植物学
关键词: 番茄溃疡病 furA和katA基因突变体构建过氧化氢
分类号: S436.412
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

番茄溃疡病（Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis,简称Cmm）是番茄（Lycopersicon culentum Mill.）生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一。该病自从1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来,现已广泛分布于美国各番茄产区,并逐渐成为世界性病害。目前番茄溃疡病在我国北京、黑龙江、吉林、内蒙古、新疆、河南、河北、山西、山东、上海、海南等省、市、自治区都有发生,使许多地区番茄生产受到了不同程度的影响。有研究表明,furA基因与katA基因可能与番茄溃疡病原菌（Cmm）致病性相关。为验证Cmm中furA基因与katA基因之间的相互关系,推测其致病机理,为抗病育种提供理论依据,我们构建了番茄溃疡病furA和katA基因的不同缺失突变体,通过电击转化的方法将其转入Cmm野生型菌株中,并分别进行了分子生物学检测和生理指标的检测。以Cmm野生菌株的基因组DNA为模板,根据furA和katA基因序列的设计特异引物,进行PCR扩增反应。PCR扩增产物电泳分析后,回收目的条带,与pMD18-T载体连接,分别命名为Cmm 1号,2号,3号,4号片段和123-T。利用BamHⅠ位点,将经过序列测定正确的目的片段从pMD18-T载体上酶切回收。用T₄ DNA连接酶分别连接1号和2号片段,3号和4号片段。之后通过PCR扩增对不同缺失片段加KpnⅠ接头,回收目的条带,连pMD18-T或pEASY-T1载体;利用KpnⅠ位点,将测序正确的目的片段从测序载体上酶切回收,用T4 DNA连接酶连接分别获得1234,12’3,12’34;上述片段PCR扩增加EcoRⅠ接头,连pMD18-T或pEASY-T1载体经EcoRⅠ酶切;同时将pHN216表达载体线性化,回收的条带。将回收的EcoRⅠ酶切1234,12’3,12’34,123加EcoRⅠ接头片段和pHN216载体片段用T4 DNA连接酶连接,连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞（DH5α）中,挑取阳性克隆进行鉴定。随后通过电击转化的方法将上述鉴定正确的转化子转入Cmm野生型菌株中。结果发现,在培养基中Fe²⁺浓度分别为0和0.5mM的情况下,Cmm野生菌株和各突变菌株,以及空载体对照的过氧化氢消耗量,显示出不同的差异。当培养基中Fe²⁺浓度为0 mM时,各处理间差异不显著;当培养基中加入0.5mM Fe²⁺时,各处理间差异显著:12’3-2（furA-katA-）和12’34-2（furA-katA+）是野生型（furA+katA+）的1.5倍;123-2（furA+katA-）是野生型（furA+katA+）的0.5倍;空载体对照与野生型相比,差异不显著。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
缩略词表  9-10
1 文献综述  10-17
  1.1 番茄溃疡病的症状特点  10
  1.2 病原菌的分类及其生物学特性  10-11
    1.2.1 分类地位  10-11
    1.2.2 生物学特性  11
  1.3 病原菌的分离、检测与鉴定方法  11-13
    1.3.1 病原菌的分离  11
    1.3.2 病原菌的检测与鉴定  11-13
  1.4 病原细菌的传播及病害流行  13
  1.5 番茄溃疡病病原细菌的存活及侵染循环  13-14
  1.6 番茄溃疡病的防治  14-15
    1.6.1 种子检疫  14
    1.6.2 抗病品种  14
    1.6.3 农业防治  14
    1.6.4 物理防治  14
    1.6.5 化学防治  14-15
  1.7 抗番茄溃疡病品种的研究  15
  1.8 病原菌国内外研究现状  15-16
    1.8.1 国内研究现状  15
    1.8.2 国外研究现状  15-16
  1.9 Cmm 基因组研究  16
  1.10 furA 基因和katA 基因概况  16-17
2 引言  17-18
  2.1 研究目的、意义及内容  17
  2.2 研究的技术路线  17-18
3 材料和方法  18-30
  3.1 材料  18-21
    3.1.1 菌株与质粒  18
    3.1.2 引物及测序  18-19
    3.1.3 培养基  19-20
    3.1.4 主要试剂及耗材  20
    3.1.5 仪器设备  20-21
  3.2 试验方法  21-30
    3.2.1 常用分子生物学试验方法  21-26
    3.2.2 重组质粒的构建及酶切鉴定  26-27
    3.2.3 表达载体的构建及酶切鉴定  27-28
    3.2.4 Cmm 突变体的构建  28-29
    3.2.5 Cmm 突变体的生理检测（H_2O_2 消耗量的测定）  29
    3.2.6 用DPS 软件分析数据  29-30
4 结果与分析  30-39
  4.1 表达载体的构建及酶切鉴定  30-37
    4.1.1 Cmm 基因片段的获得及重组质粒的构建  30-33
    4.1.2 Cmm 突变体片段和pHN216 载体片段的连接、转化  33-35
    4.1.3 转化子的鉴定  35-37
  4.2 Cmm 突变菌株的获得及生理检测  37-39
    4.2.1 突变菌株的获得  37
    4.2.2 Cmm 突变菌株的生理检测（H_2O_2 消耗量的测定）  37-39
5 结论和讨论  39-41
  5.1 重组质粒及表达载体的构建  39
  5.2 测序载体的连接  39
  5.3 Cmm 突变菌株H_2O_2 消耗量的测定  39-40
  5.4 铁离子与Fur 蛋白的关系  40-41
参考文献  41-46
ABSTRACT  46-48
附录一：基因结构线条简图  48
附录二：Shuttle Vetor E.coil/Clavibacter  48-49
附录三：Cmm furA-katA 基因序列  49-50

番茄溃疡病furA和katA基因突变体的构建

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