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鸳鸯鸭MHCⅠ类分子蛋白表达与结构分析及其限制性病毒T细胞表位的筛选

作　者: 孙凯
导　师: 崔保安
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸳鸯鸭 MHCⅠ类分子蛋白表达结构与功能分析禽流感病毒T细胞表位
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)广泛存在于所有有核细胞表面,是由MHCⅠ类基因编码的重链(α链)同另一条染色体上β2m基因编码的轻链(β2m链)以非共价键连接而组成,它可以和病毒的某些抗原多肽结合,将多肽递呈到细胞表面,被CTL细胞的TCR识别,诱导机体产生细胞免疫应答,这些多肽被称为T细胞表位。为了阐明鸭MHCⅠ的特征,进一步体外重建鸭MHCⅠ-β2m复合体来鉴定禽源病毒的T细胞表位,我们进行了以下研究:1采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织提取的RNA中克隆了鸳鸯鸭MHCⅠ类分子的α和β2m链基因。结果显示,克隆获得的909bpα链基因中包含1个完整的α链胞外区(功能区)成熟肽基因序列以及部分跨膜区基因序列和信号肽序列,共编码303个氨基酸。α链胞外区成熟肽长度为271个氨基酸,其包含92个氨基酸的α1区,89个氨基酸的α2区,90个氨基酸的α3区,在α2、α3区域分别存在2个半胱氨酸残基,有1个潜在的N-糖基化位点。分析发现不同物种α2、α3区域差异较大,进化关系显示鸭比鱼类、蛙、鸡等低等脊椎动物更接近人类MHCⅠ类分子,推测其在动物MHCⅠ类分子的起源与分化中占有重要的位置。所克隆的440bp鸳鸯鸭β2m链基因中,前297bp为β2m链成熟肽基因,共编码99个氨基酸,成熟肽第25位和80位为半胱氨酸(C),且在第80位半胱氨酸附近序列为“YTCRVDH”,这与免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”相符。与GenBank中已登陆的北京鸭β2m链基因序列(AB246408)同源性为100%,证明了其高度保守性。2用pET-28a(+)/E.coli表达系高效表达了鸳鸯鸭MHCⅠ类分子的α链胞外区和β2m链成熟肽,经SDS-PAGE显示目的蛋白大小分别为31.0 KDa和11.4 KDa,BandScan软件分析显示,目的蛋白的含量分别约占细菌总蛋白29.8%和36.5%。对克隆的鸳鸯鸭MHCⅠ类分子的α链胞外区和β2m成熟肽基因核苷酸序列推导的氨基酸序列进行了二级结构(2D)、三级结构(3D)分析,结果显示鸳鸯鸭MHCⅠ类分子的α链胞外区链成熟肽具有典型的α螺旋结构,其中β-折叠含量最少,为13%;α-螺旋和β-转角含量都在24%;其它松散结构含量最为丰富,分布为40%。β2m链成熟肽蛋白中四种元件组成相对均衡,其中α-螺旋、β-转角和其它松散结构含量较多,为26%,β-折叠含量则较少,为21%。同源建模的α链胞外区成熟肽的抗原多肽结合区(PBD)由2个反向平行的α螺旋和8条β片层组成,这同人(HLA-A2)和小鼠(H2)结构类似,β2m链成熟肽3D结构与人及小鼠的类似,但在α螺旋、β折叠、转角和其他松散结构的具体位置与数目方面存在微小差异。3根据鸳鸯鸭MHCⅠ类分子α链胞外区β2m链成熟肽的结构和功能筛选出了3条可能为体外重建的鸳鸯鸭MHCⅠ-β2m复合体所结合的禽流感病毒(Influenza A virus (A/duck/Henan/1652/2006(H5N1))核衣壳蛋白T细胞表位NP71-79(FDERRNRYL)、NP217-215 (IAYERMCNI)和NP380-388 (LERSRYWAI)。综上所述,本研究揭示了鸳鸯鸭MHCⅠ类和β2m基因的特征,获得了具有正常功能结构的鸳鸯鸭MHCⅠ类分子的α链胞外区和β2m链成熟肽,阐明了其2D结构组成及3D结构、功能,并在此基础上筛选了鸳鸯鸭MHC I-β2m复合体可能结合的禽流感病毒T细胞表位,为进一步构建鸭MHCⅠ-β2m复合体体外鉴定禽流感病毒及其它病毒T细胞表位平台奠定了基础。

鸳鸯鸭MHCⅠ类分子蛋白表达与结构分析及其限制性病毒T细胞表位的筛选

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