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邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠精子的联合毒性研究

作　者: 黄玉晶
导　师: 舒为群
学　校: 第三军医大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 邻苯二甲酸二丁酯苯并[a]芘联合作用雄性生殖毒性精子发生生精细胞蛋白表达
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants),简称POPs,指的是持久存在与环境中,具有很长半衰期,并且能通过食物链积聚,并对人类健康及环境造成不利影响的有机化学物质。POPs对人类和环境带来的危害已成为全球性环境问题。由于目前世界上POPs物质有几千种,在有限的财力、物力、人力条件下,很难全面进行研究。因此,选择本地区需要优先监测和关注的环境及人群体内的优先POPs(priority POPs)进行研究,对于高效率的环境监测、污染治理以及健康防护具有非常重要的意义。本课题组前期研究发现三峡库区水环境中的污染物以多环芳烃类物质和邻苯二甲酸酯类的检出频率和检出浓度最高。本实验拟以含量较高的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)做为邻苯二甲酸酯类物质代表,以毒性较强的苯并[a]芘(Bap)做为多环芳烃类物质代表,对这两类物质联合毒性进行研究。有文献报道,DBP、Bap均具有确切的雄性生殖毒性,但两者低剂量联合作用下雄性生殖毒性特别是针对生精细胞的毒性及机制研究尚未见报道。本研究注重突出联合亚慢性毒性,以DBP与Bap低剂量联合作用于雄性大鼠,从毒性效应和机制两个层次开展研究,观察其联合毒性作用及机制,可为客观评价及预测POPs污染对人群健康的损害、建立环境健康效应的预警体系打下很好的基础。试验方法1.实验动物及分组情况4-5周龄健康雄性SPF级SD大鼠245只,由第三军医大学实验动物中心提供,按随机数字法随机分为7组(每组35只),分别为对照组(玉米油)、Bap低剂量组(Bap 1 mg/kg)、Bap高剂量组(Bap 5 mg/kg)、DBP低剂量组(DBP 50 mg/kg)、DBP高剂量组(DBP 250 mg/kg)、DBP+ Bap低剂量组(DBP 50 mg/kg +Bap 1 mg/kg)、DBP+ Bap高剂量组(DBP 250 mg/kg +Bap 5 mg/kg)。2.染毒及取材采取隔天灌胃的方式进行染毒,连续染毒90d。30d、60d、90d时每组各处死8只,处死前称体重,10%水合氯醛腹腔麻醉,采集心脏血后,立即处死剖取睾丸、附睾、心、肝、脾、肾,称重后将睾丸于冰上迅速切分为约50 mg- 100 mg的小块,分装于冻存管中液氮保存。血液离心后取血清于-70℃保存,用于测定激素。每组留4只90d后与健康雌性SPF级SD大鼠交配,观察生育能力。每组随机取1只大鼠的左侧睾丸,冰上迅速取材后固定于2.5%戊二醛,然后梯度酒精脱水、环氧树脂渗透、包埋、切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,透射电镜下观察。随机选取5只大鼠的右侧睾丸,4%多聚甲醛固定液中固定,常规石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察,拍照,通过计算机图像分析软件(DP72-BSW)测定生精小管和睾丸面积,计算生精小管平均横截面积和生精小管与睾丸面积比。随机选取8只大鼠单侧附睾,置于0.09%生理盐水内洗去血水,将洗净的附睾置于生理盐水内用眼科剪剪碎,轻压组织碎块,静置2 min- 3 min释放出精子,显微镜下观察精子活性和畸形、计数精子数。随机选取6只大鼠单侧睾丸(90d时相点对照组和高剂量染毒组(Bap 5组、DBP 250组、B5+ D250组)各多选1只用于蛋白表达分析)用组合酶法分离生精细胞。生精细胞分化情况分析:将生精细胞悬液用PBS洗2次,加1 mg/ ml RNA酶37℃孵育30 min,加入碘化丙碇4℃染色30 min,通过流式细胞仪进行相关分析(分析软件:Cellquest)。生精细胞蛋白表达分析:提取生精细胞悬液总蛋白进行等电聚焦和SDS-PAGE,使用软件ImageMaster 2D Platinum 5.0分析各组蛋白表达差异;切下具有表达差异的蛋白点使用MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker Ultraflex)进行质谱分析(N2激光器(发射波长337 nm),加速电压25 KV),使用软件moverz和peakErazor分析质谱图,通过用mascot收索引擎检索鉴定蛋白。3.统计方法使用SPSS软件进行统计,交配实验结果使用卡方检验,其他结果使用单因素方差分析。结果与讨论1.邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠生长发育的影响各染毒组与对照组的大鼠体重变化各组之间无显著性差异,说明本实验两种化合物的染毒剂量及染毒时间对大鼠的消化吸收与能量代谢无明显影响,不会对大鼠生长发育没有造成过度的压力而影响实验结果。各组大鼠的心脏系数、脾脏系数、肾脏系数和睾丸脏器系数各组间无显著性差异(P>0.05),可认为本实验两种化合物的染毒剂量及染毒时间不会对大鼠的心脏、脾脏、肾脏和睾丸产生明显毒性作用。肝脏器系数在染毒30d时低剂量联合组出现明显降低(与其它各组比均有显著性,P<0.05),在染毒60d和90d时差异消失(P>0.05)。提示肝脏不仅是Bap和DBP的代谢器官,也是其靶器官,低剂量联合染毒可导致肝脏急性损伤,引起脏器系数的降低,这种肝脏毒性可能为短期效应,长期染毒时机体逐渐对其耐受。染毒90d两者低剂量联合染毒组与对照组相比附睾脏器系数显著性下降(P<0.05),可能由于两者低剂量联合染毒对附睾的损伤逐渐超过机体的耐受能力,造成附睾萎缩。2.邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘睾丸形态学影响2.1电镜观察与对照组相比,各染毒组电镜下均可见不同程度的细胞超微结构损伤,主要表现为生精细胞线粒体肿胀、固缩,内质网扩张。Bap低剂量单独染毒组(Bap1组)前期损伤较小,染毒90d时出现染色质聚集和脂滴。DBP低剂量单独染毒组(DBP50组)在染毒初期和中期超微结构病理改变比较重,90d时开始恢复。Bap和DBP低剂量联合染毒组(B1+ D50组)从超微结构观察整个染毒过程中损伤较小,在60d时有内质网和线粒体肿胀形成髓鞘样结构以及染色质聚集。Bap高剂量单独染毒组(Bap5组)在整个染毒过程中受影响较大,超微结构观察染毒30d时可见细胞严重损伤,结构破坏,层次不清;60d可见细胞水肿,间隙增大;90d时内质网扩张、线粒体水肿、出现大量脂滴。DBP高剂量单独染毒组(DBP250组)在30d和90d时未出现严重的超微结构病理改变,60d时可见细胞结构破坏、层次不清。Bap和DBP高剂量联合染毒组(B5+ D250组)与DBP类似,30d和90d时超微结构病理改变较小,存在部分线粒体固缩,60d时可见生精细胞从基膜脱落。2.2光镜观察光镜观察发现不论是Bap和DBP的单独染毒还是联合染毒,都存在一定层度的生精细胞层数减少、空泡化、生精细胞间隙增大以及生精细胞脱落,有的还能观察到间质细胞增生。与Bap相比,DBP对睾丸组织形态学影响出现的要早,在染毒30d时候就出现生精细胞间隙增大、层数减少;联合染毒组的表现主要在于高剂量联合染毒60d时可见间质细胞增生,而生精细胞本身变化在形态学上并不明显。2.3计算机图像分析我们运用计算机图像分析软件在光镜下进行分析,发现:曲细精管横截面积比较可见各染毒组曲细精管均有不同程度的萎缩。Bap和DBP低剂量联合染毒组出现最早,30d就显著性差异(与对照组比,P<0.05),60d时差异不明显(与对照组比,P>0.05),90d时又出现显著性差异(与对照组比,P<0.05),体现了一个损伤→代偿→失代偿的过程;其次是DBP低剂量单独染毒组,在第60d开始出现曲细精管明显萎缩,与对照组比有显著性差异(P<0.05),90d是差异持续存在,是一个逐渐损伤的过程;其他4组(Bap低剂量单独染毒组、Bap高剂量单独染毒组、DBP高剂量单独染毒组、两者高剂量联合染毒组)均在30d、60d与对照比差异不明显(P>0.05),90d时与对照组比有显著性差异(P<0.05)。与其电镜、光镜观察结果相比较,可以看出一个由超微结构→细胞→组织的损伤或修复的时间顺序。曲细精管占睾丸体积百分比在60d、90d时各染毒组与对照相比无显著差异(P>0.05),在30d时DBP单独染毒组(DBP50组、DBP250组)与其他各组相比均显著升高(P<0.05)。通过与曲细精管横截面积变化结果相比较,我们推测30d时DBP单独染毒组其曲细精管占睾丸体积百分比增加可能是由于其间质组织萎缩引起,而90d时各染毒组可能都出现了不同程度间质组织萎缩。3.邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠生殖能力的影响3.1精子数量和质量分析临床评价男性生育能力的三个常规指标精子计数、成活率以及活性,染毒90d时各组间无显著性差异(P>0.05),提示我们的染毒剂量外推到人群时,该剂量下临床生育能力检查可能不会发现明显改变,不易引起重视。精子计数结果与90d时附睾脏器系数比较,我们认为两者低剂量联合染毒组90d时与对照组相比附睾脏器系数显著性下降(P<0.05),可能不是因为精子数下降而是由于附睾内附睾管上皮细胞减少,这些细胞参与构成附睾内精子成熟、精子运动能力和受精能力的获得和发育所必需的微环境,它们的损伤将会影响精子成熟以及精子运动能力和受精能力的获得和发育,此外作为附睾功能重要调控因素的睾酮在血清中浓度下降将会加剧这种影响。根据文献报道,进入附睾的精子在结构上已经趋于完整,因此这种影响在引起精子畸形方面主要表现为断头畸形的增加,这与我们的精子畸形观察结果一致,我们在试验中发现Bap和DBP低剂量联合暴露引起的精子畸形增加主要表现为断头畸形。DBP高剂量染毒组在染毒90d时畸形精子的数量明显增加(与对照组比P<0.05),低剂量联合组在染毒90d精子畸形率增加更显著,高于对照组、单独剂量组以及联合高剂量组(P<0.05),结合附睾脏器系数的改变,我们认为在低剂量时,两者联合后在生殖毒性上显示出加强效应。3.2生殖相关激素的改变低剂量联合染毒组血清T水平与对照组、Bap低剂量组相比在30d、90d显著下降(P<0.05),而60d时无显著差异(P>0.05),呈现出一个典型的损伤→代偿→失代偿的过程。血清LH水平变化与我们血清T水平的相反,低剂量联合染毒组90d时与对照组相比显著升高(P<0.05),推论本试验所用的染毒剂量长期单独或联合暴露染毒对青春期SD大鼠血清LH水平没有直接影响,其LH水平改变可能来源于血清T水平改变引起的负反馈调节,其对睾酮浓度的影响不是通过LH浓度改变,而是在LH之后的途径,例如抑制间质细胞功能、增强肝脏对睾酮代谢等。3.3对大鼠繁殖能力影响的分析Bap高剂量染毒和两者高剂量联合染毒会造成死胎和吸收胎出现率显著高于对照和DBP高剂量单独染毒(P<0.05)。因此我们认为虽然Bap高剂量单独或两者高剂量联合长期暴露后虽然在一般生长发育指标、生育能力常规指标(精子计数、精子存活率、精子活性、精子畸形)及激素水平上与对照相比均没有明显改变,但是其生育能力已经受到影响。4.邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对生精细胞分化和蛋白表达的影响4.1生精细胞分化改变我们发现Bap和DBP低剂量联合染毒在精子发生上表现出早期兴奋(30d、60d)而后期逐渐失代偿并出现抑制(90d)的效应,主要集中在减数分裂阶段;单独低剂量染毒也早期有类似效应,但出现兴奋的时间要晚于联合染毒(60d),晚期机体逐渐对其耐受,兴奋效应消失(90d),从而在联合效应上出现协同→拮抗→协同的变化。高剂量组Bap单独染毒对精子发生过程始终没有显著影响,DBP高剂量单独染毒和低剂量单独染毒类似,从中期(60d)开始出现兴奋效应;两者高剂量联合在中期开始表现出以DBP效应为主,Bap对其拮抗。4.2生精细胞蛋白表达改变分析通过比较各组二维电泳图,我们共得到35个表达差异蛋白点,我们将这35个点通过蛋白质谱鉴定,有5个点未得到结果(无峰),剩下30个点中有11个为阴性结果(分值小于60),最后得到19个有阳性意义的蛋白,对比这些蛋白在各组间的差异,我们发现:与精子发生密切相关的核内不均一核糖核蛋白在高剂量联合染毒组表达与Bap高剂量单独染毒组相比增强;在精母细胞的分化、精子在附睾内的成熟、精子获能和顶体反应过程中起重要作用的肿瘤拒绝抗原gp96在高剂量联合染毒组中比Bap高剂量单独染毒组表达降低;参与精原细胞有丝分裂和减数分裂并在其中其重要作用的β肌动蛋白在高剂量联合染毒组中比Bap高剂量单独染毒组表达降低。这几种蛋白表达差异可能是造成染毒90d时高剂量联合染毒组中与Bap高剂量单独染毒组相比在光镜、电镜照片中形态学损伤小而在流式细胞计数中却出现明显的精子发生过程受影响、减数分裂受阻的原因。参与染色质组装或分解、转录、调控转录以及DNA依赖、负调控转录、染色质修饰,与DNA结合、染色质结合、转录抑制因子相关的色素框同源物2在Bap高剂量单独染毒组表达消失(与高剂量联合染毒组、对照组比均有差异),这可能与Bap高剂量生精上皮结构破坏有关。与减数分裂、精子尾部鞭毛装配、维持细胞核形态等密切相关β-微管蛋白在Bap高剂量单独染毒组中特异性表达(与对照组相比),推测是Bap高剂量单独染毒引起生精上皮结构破坏导致β-微管蛋白过度表达;白蛋白在Bap高剂量单独染毒时候在生精细胞中表达增加(与对照组、高剂量联合染毒组相比),可能是由于Bap高剂量单独染毒引起生精上皮结构破坏,血睾屏障被破坏而致使白蛋白渗漏进生精上皮内部引起。与铁转运相关的血红素结合蛋白在各染毒组生精细胞中表达与对照组相比均上升,Bap高剂量单独染毒组与对照组相比还存在转铁蛋白表达上升,提示Bap和DBP长期染毒引起睾丸损伤作用与铁有关。高剂量联合染毒与Bap高剂量单独染毒相比,与线粒体的能动性相关的多毛蛋白表达消失,提示高剂量联合染毒生精细胞内线粒体活动性比Bap高剂量单独染毒要强,这可能是我们在电镜照片下发现90d时高剂量联合染毒组线粒体损伤远低于Bap高剂量单独染毒组的原因之一。广泛参与体内脂肪族及芳香族醛类代谢的线粒体乙醛脱氢酶在各染毒组生精细胞中均出现线粒体乙醛脱氢酶特异性表达(与对照组相比),推测其可能参与睾丸对DBP和Bap及其代谢产物的生物转化。高剂量联合染毒组与DBP高剂量单独染毒组相比糖代谢途径限速酶之一的丙酮酸激酶3的2亚型表达消失,提示两者能量代谢系统存在差异。结论1. DBP和Bap染毒对大鼠生育能力影响DBP和Bap长期低剂量联合染毒可引起血清T水平显著下降,同时还损伤附睾内微环境导致精子断头畸形增加。Bap高剂量单独或Bap和DBP高剂量联合长期暴露不会影响一般生长发育指标、生育能力常规指标及激素水平,但能够影响雄性大鼠的生殖能力。睾丸形态学改变:①Bap低剂量单独染毒前期损伤较小,后期出现损伤;DBP低剂量单独染毒在初期损伤较大,后期开始恢复;②Bap和DBP低剂量联合染毒全程损伤较小,呈现拮抗效应,两者高剂量联合染毒在形态学方面表现以DBP表现为主;②各染毒组曲细精管均有不同程度的萎缩。2. DBP和Bap染毒对大鼠生精细胞分化及蛋白表达的影响DBP和Bap低剂量联合染毒主要影响精子减数分裂阶段,表现为早期兴奋而后期逐渐失代偿并抑制;单独低剂量染毒早期有类似效应,但出现兴奋的时间要晚于联合染毒,晚期兴奋效应消失,从而在联合效应上出现协同效应→拮抗效应→协同效应的变化。高剂量组Bap单独染毒对精子发生没有显著影响,DBP高剂量单独染毒和低剂量单独染毒类似,从中期开始出现兴奋效应;两者高剂量联合在中期开始表现出以DBP效应为主,Bap对其拮抗。二维电泳和质谱分析表明各染毒组与对照组相比均出现血红素结合蛋白表达上升,线粒体乙醛脱氢酶特异性表达;Bap高剂量单独染毒组与对照组相比色素框同源物2表达消失,β-tubulin特异性表达,白蛋白、转铁蛋白表达上升;高剂量联合染毒组与DBP高剂量单独染毒组相比丙酮酸激酶3的2亚型表达消失,与Bap高剂量单独染毒组相比核内不均一核糖核蛋白增强,肿瘤拒绝抗原gp96、β-actin、白蛋白表达降低,多毛蛋白表达消失。

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英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-12
中文摘要  12-19
论文正文邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠精子的联合毒性研究  19-112
  第一部分研究背景和研究方法  19-35
    前言  19-22
    材料与方法  22-34
    技术路线  34-35
  第二部分邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠生长发育及睾丸形态的影响  35-58
    结果  35-53
    讨论  53-57
    小结  57-58
  第三部分邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠生育能力影响  58-69
    结果  58-65
    讨论  65-68
    小结  68-69
  第四部分邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠生精细胞分化程度影响  69-87
    结果  70-84
    讨论  84-86
    小结  86-87
  第五部分邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠生精细胞蛋白表达影响  87-104
    结果  87-97
    讨论  97-102
    小结  102-104
  全文总结  104-106
  创新点、不足、进一步科研设想  106-107
  致谢  107-108
  参考文献  108-112
文献综述苯并[a]芘的代谢及其雄性生殖毒性研究进展  112-122
研究生期间发表的文章  122

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