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β-葡萄糖苷酶的回收与固定化及在纤维素酶水解中的应用

作　者: 杨露
导　师: 余世袁
学　校: 南京林业大学
专　业: 生物化工
关键词: β-葡萄糖苷酶回收固定化连续水解
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

化石能源的大量消耗造成了严重的能源危机与环境污,世界各国在努力寻求一种新型可替代的能源,燃料乙醇是目前研究的热点之一,但是其成本限制了工业应用,其中最大的影响因素为酶的成本问题,本论文以此为出发点研究了β-葡萄糖苷酶的固定化回收利用及其在酶解上的应用。其结果如下:通过对有机法低温下回收β-葡萄糖苷酶的研究表明:在利用乙醇回收酶的方法中,需要添加一定的沉淀助剂,正丁醇、洗衣粉及乙酸乙酯三种沉淀助剂中,乙酸乙酯的效果最佳。在20ml的酶解体系中,加入20ml的乙醇和4.45ml的乙酸乙酯或者加入25ml的乙醇和2.10ml的乙酸乙酯这两种添加方式能够达到最佳的回收效果。两者在连续回收30轮后都能使酶活力保持初始的90%以上,在40轮以后,后一种回收方法稳定性更好,在50轮左右时酶活力回收率才降到了80%以下。这也就为有机法回收蛋白质找到了一种新的思路,也丰富了有机法回收的内容与方法。在利用陶瓷颗粒固定化商品β-葡萄糖苷酶的研究中,利用交联剂交联β-葡萄糖苷酶,然后再进行冷冻干燥,最后用溶于丙酮的有机酸油性胶粘剂包裹固定化,这是一种比较好的固定化方式。该固定化方式比直接用胶粘剂或不加交联剂的固定化方式更好,也更加稳定。对固定化的单因素研究表明:采用15IU/g陶粒的β-葡萄糖苷酶用量,1%戊二醛溶液,25℃、pH 4.8、100r/min交联2h,然后冻干加入0.1g胶粘剂A固定化的效果是最佳的。从固定化酶的蛋白质含量上分析,固定化酶蛋白占初始的29.4%。用此方法制备的固定化酶的最适pH及最适温度与游离酶的是一样的,最适温度为65℃、最适pH为4.5。但是pH及热稳定性,固定化酶显示出了比游离酶更强的适应性:固定化酶的在pH 5.5左右最为稳定,同时在pH 3.0~10.0之间稳定性也比较好;游离酶的pH在3.0~6.0之间都比较好,但是在高于7.0后,酶活力开始迅速下降。在热力学稳定性上,固定化酶在30℃~70℃之间酶活力比较稳定,游离酶则在30℃~60℃比较稳定。以对硝基苯基-β-D葡萄糖苷为底物时Km值分别为0.89mmol/l和16.6mmol/l。通过对固定化酶的蛋白质分析研究发现,固定化颗粒中含有约初始加入酶蛋白的30%左右,但酶活力显示却比较低。利用该固定化酶对含30g/l葡萄糖和30g/l的纤维二糖的纤维素酶水解蒸汽爆破液玉米秸秆水解液进行连续水解,在50℃、pH 4.8、5r/min的条件下连续酶解,在进行31天后,酶解效率保持在90%以上,葡萄糖平均含量为59.25g/l,纤维二糖平均含量为2.78g/l。这说明该固定化酶的酶解效果比较好,同时操作稳定性也很好。由此可见固定化酶有很好的应用前景。

全文目录

致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-9
1 前言  9-11
  1.1 研究背景  9
  1.2 立题依据  9-11
2 文献综述  11-18
  2.1 木质纤维原料的组成  11-12
  2.2 木质纤维原料的水解  12
  2.3 β-葡萄糖苷酶的回收  12-18
    2.3.1 沉淀(结晶)法及其研究进展  12-13
    2.3.2 固定化法及其研究进展  13-17
      2.3.2.1 固定化方法  13-15
      2.3.2.2 β-葡萄糖苷酶固定化研究进展  15-17
    2.3.3 其他回收方法及其进展  17-18
3 有机法回收β－葡萄糖苷酶  18-29
  3.1 实验材料与方法  18-20
    3.1.1 实验材料  18
      3.1.1.1 主要试剂  18
      3.1.1.2 主要仪器  18
    3.1.2 实验方法  18-20
      3.1.2.1 β－葡萄糖苷酶的有机回收方法  18-19
      3.1.2.2 β-葡萄糖苷酶的酶活测定  19
      3.1.2.3 酶解液中的各糖组分含量的测定  19-20
  3.2 结果与讨论  20-27
    3.2.1 乙醇用量对酶的回收的影响  20-21
    3.2.2 不同沉淀助剂对酶回收的影响  21-22
    3.2.3 不同乙醇－乙酸乙酯混合用量对酶回收的影响  22-23
    3.2.4 乙酸乙酯－乙醇混合体系多轮连续回收β－葡萄糖苷酶  23-27
      3.2.4.1 不同温度对酶活力回收的影响  23-27
  3.3 小结  27-29
4 β－葡萄糖苷酶的固定化  29-48
  4.1 材料与方法  29-34
    4.1.1 主要试剂  29
    4.1.2 仪器  29-30
    4.1.3 固定化酶的制备  30-31
      4.1.3.1 直接胶粘法  30
      4.1.3.2 不同预处理陶瓷颗粒固定化酶  30-31
    4.1.4 β－葡萄糖苷酶的酶活测定  31
    4.1.5 酶解液中的各糖组分含量的测定  31
    4.1.6 蛋白质含量分析  31-33
    4.1.7 固定化酶扫描电镜分析  33-34
      4.1.7.1 陶粒外表面  33
      4.1.7.2 陶粒内表面  33-34
  4.2 结果与讨论  34-47
    4.2.1 不同固定化方式的比较  34-37
      4.2.1.1 不同胶粘剂和载体的直接固定化  34-35
      4.2.1.2 不同预处理陶粒胶粘固定化法比较  35-36
      4.2.1.3 不同预处理陶粒交联－胶粘法固定化比较  36-37
    4.2.2 固定化酶的影响因素  37-41
      4.2.2.1 吸附时间对固定化的影响  37-38
      4.2.2.2 酶用量对固定化的影响  38-39
      4.2.2.3 交联剂用量对固定化物影响  39
      4.2.2.4 不同交联时间对固定化的影响  39-40
      4.2.2.5 胶粘剂用量对固定化的影响  40-41
      4.2.2.6 反应体积对固定化的影响  41
    4.2.3 酶蛋白质分析  41-42
    4.2.4 固定化酶电镜分析  42-47
  4.3 小结  47-48
5 固定化酶的酶学性质  48-54
  5.1 实验方法与材料  48-49
    5.1.1 最适pH的测定  48
    5.1.2 pH稳定性的分析  48
    5.1.3 最适温度的测定  48
    5.1.4 热稳定性的分析  48
    5.1.5 米氏常数K_m值的测定  48-49
  5.2 结果与讨论  49-52
    5.2.1 酶的最适pH及pH稳定性  49-50
    5.2.2 酶的最适温度及热稳定性  50-52
    5.2.3 酶的米氏常数K_m值的测定  52
  5.3 小结  52-54
6 固定化酶的连续水解  54-68
  6.1 材料与方法  54-55
    6.1.1 主要试剂及仪器  54
    6.1.2 水解液的制备  54
    6.1.3 水解液中糖组分的测定  54
    6.1.4 固定化酶水解设备  54-55
  6.2 结果与讨论  55-65
    6.2.1 水解液成分分析  55-57
    6.2.2 不同游离β－葡萄糖苷酶用量的酶解过程  57-58
    6.2.3 不同糖浓固定化柱子酶解  58-59
    6.2.4 不同流速对酶解的影响  59-61
    6.2.5 不同pH对酶解的影响  61-62
    6.2.6 不同温度对酶解的影响  62-63
    6.2.7 固定化酶连续水解  63-65
  6.3 经济性分析  65-67
    6.3.1 固定化酶与游离酶的比较  65
    6.3.2 固定化酶与有机法回收的比较  65-67
  6.4 小结  67-68
7 论文总结  68-70
  7.1 结论  68-69
  7.2 论文创新与突破之处  69
  7.3 论文有待探索之处  69-70
参考文献  70-74

β-葡萄糖苷酶的回收与固定化及在纤维素酶水解中的应用

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